《PCR原理、引物设计》.ppt

聚合酶链式反应(PCR)及引物设计 刘彩云 2011年7月22日 Content 聚合酶链式反应（PCR） 的技术原理及实验操作 PCR引物设计软件的使用（ Primer Premier 5.0 ） 聚合酶链式反应（PCR） 实验目的 了解PCR的基本原理 掌握PCR的基本操作技术 学习引物设计的原则及引物设计软件Primer5的使用 聚合酶链式反应（PCR） 实验原理 PCR技术原理 引物设计的原则 PCR的成分和作用 PCR反应体系 PCR反应条件优化 PCR的应用 PCR技术原理 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为基因的体外扩增法。 PCR不仅可以用于基因的分离、克隆和核苷酸序列分析，还可以用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析，遗传病和传染病的诊断，肿瘤机制的探索，法医鉴定等诸多方面。 PCR技术原理 以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板5′末端和3′末端互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成，重复这一过程，即可使目的DNA片段得到扩增。 PCR技术原理 PCR技术原理 PCR出现的问题： PCR扩增未得到目的条带？ 扩增出目的条带之外的多条带（非特异性）？ 扩增的目的条带很弱？ 实验原理 PCR技术原理 引物设计的原则 PCR的成分和作用 PCR反应体系 PCR反应条件优化 PCR的应用 引物设计的原则 引物与模板的序列要紧密互补 引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构 引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。 引物设计的原则 引物长度（primer length） 产物长度（product length） 序列Tm 值(melting temperature) 形成引物二聚体(primer dimer)及发夹结构（duplex formation and hairpin）的能值 在错配位点（false priming site）的引发效率 引物及产物的GC 含量（composition） 引物设计的原则 1. 引物的长度：配对引物的长度一般在15-30bp之间比较合适。 尽可能使用两条引物的Tm值相同（最好相差不要超过 5℃） Tm值的计算：一般的公式：Tm = 4 (G+C) + 2(A+T) 2. 引物的GC%含量：一般为40%-60%。上下游引物的GC含量不能相差太大。 引物设计的原则 3. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。 4. 引物3’端的末位碱基避开密码子的第3位，且最好不选择A 5. 引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。 引物设计的原则 6. 引物无回文对称结构，否则会形成发夹结构； 引物自身不能配对，否则易形成约两个引物长度的引物二聚体； 实验原理 PCR技术原理 引物设计的原则 PCR的成分和作用 PCR反应体系 PCR反应条件优化 PCR的应用 PCR的成分和作用 1. 缓冲液： 10 ～ 50 mM Tris- Cl (pH8.4) 维持 Taq 酶作用环境 25 ～ 50 mM KCl 促进引物退火 100μg / ml 牛血清白蛋白 (BSA) 对酶有一定的保护性 0.5 ～ 2.5 mM MgCl2 Taq 酶具有 Mg2+依赖性 2. dNTPs : dATP、 dGTP 、dCTP、dTTP——底物 0.5 ～ 2.5 μM PCR的成分和作用 3. 引物 (Primer-P)： 预扩增核酸片段两端的已知序列，决定特异性。 0.1 ～ 1 μM 4. 模板DNA (Template): 最低102 ～ 105 DNA片段，实际用量远远 超过此量，用量需在实验中摸索。1 ～ 5 μl PCR的成分和作用 5. Taq DNA 聚合酶 耐高热 0.5 ～ 5 U / 100 μl 1U / 25 ～ 50μl 6. 水： 去离子水，补足整个反应体积。 实验原理 PCR技术原理 引物设计的原则 PCR的成分和作用 PCR反应体系 PCR反应条件优化 PCR的应用 PCR反应体系 常用30μl 各种成分的实际用