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实时荧光定量PCR技术的原理及应用(Real time Quantitative PCR) 实时荧光定量PCR定义 在PCR反应体系中加入荧光基团，通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪,利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后结合相应的软件通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 荧光定量 PCR仪 荧光定量PCR仪是一种带有激发光源和荧光信号检测系统的PCR仪，通常配有电脑系统及相应的分析软件。 Cross-section of rotary optics Rotary optics 3D animation 实时荧光定量PCR的特点 不必要做传统费时的电泳检测 特异性强,灵敏度高 PCR扩增和检测在同一处进行,减少了实验室的占用空间 可直接对产物进行定量 通过对熔解曲线的分析，可以对扩增PCR产物进行序列测定 解决PCR污染问题 自动化程度高、操作简单 实时荧光定量PCR 原理 常 规 PCR技术： 对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析,无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测 实时定量PCR技术： 利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析 荧光定量PCR标记方法 内掺式染料 SYBR Green I 序列特异性探针 Taqman Molecular Beacons Dual Probes(FRET) 引物特异性探针 Amplifluor (Intergen) 水解探针或Taqman探针： 这种探针用于Taqman分析法，它能被DNA合成酶(例如Taq酶)所降解，探针的5’端有一荧光报告基团，3’端有一荧光淬灭基团，当两个基团相互先靠近的时候，由于发生能量传递作用，报告基团不能发出荧光，但随着扩增反应的进行，5’端的报告基团随着探针的水解而脱落下来，不再与淬基团灭发生能量传递作用，从而能发出荧光，被信号探测器所捕获。 荧光定量实时PCR与普通PCR的比较 实时在线监控 对样品扩增的整个过程进行实时监控,能够实时地观察到产物的增加,直观地看到反应的对数期 降低反应的非特异性 使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合,提高了PCR反应的特异性 增加定量的精确性 通过对每个循环中PCR靶序列的精确量化，使该系统具有很高的精确性；全程监控,准确的算法进行定量 结果分析更加快捷方便,无需跑胶 定量—— 绝对标准曲线方法 标准品：纯化的质粒dsDNA，体外转录的RNA 准确配制标准系列并且注意其稳定性，最好分装后保存于-80℃ 荧光材料：杂交探针、水解探针或SYBR Green I 不可以使用DNA作为标准品对RNA进行定量 应用于定量病毒荷载量等 定量—— 相对标准曲线方法 指在测定目的基因的同时测定某一内对照基因，用一系列已知外参物做标准曲线，根据该标准曲线得到目的基因和内对照基因的量，再将目的基因的同内对照基因的比值作为定量的最后结果 标准品：含有目标基因的DNA或RNA 一般选用看家基因校正 常选择看家基因GAPDH 、β2-M、rRNA 在假设样品逆转录效率相同的前提下，可以使用DNA的标准曲线对RNA进行定量 较常用的一种方法 比较Ct法 假设目的基因与看家基因扩增效率相同，数学推导得出 目的基因的量=2-ΔΔCt ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct管家基因)实验组-(Ct目的基因-Ct管家基因)对照 2-ΔΔCt表示的是实验组目的基因的表达相对于对照组的变化倍数 在目的基因与看家基因扩增效率相同的情况下可以直接得到的目的基因相对于管家基因的定量，而不必制作标准曲线 更为简便省时，也是相当可靠的 重 复 性 问 题 判断实验结果优劣的重要指标 主要判断指标为标准差（SD）和变异系数（CV） 影响结果重复性的因素 PCR 反应扩增的效率 优化实验条件，使反应体系达到最佳扩增效率 目的基因的初始浓度 使用初始浓度具有较高数量级的样本或作平行孔 标准曲线的影响 5个稀释度的标准品，涵盖待测样本中目的基因量可能出现的全部浓度范围 理想的标准品应与样本具有高同源性 ：质粒DNA 或是体外合成、转录的RNA 影 响 敏 感 度 的 因 素 反应体系中形成的引物二聚体的影响 可以用水解探针代替SYBR Green I，有文献报导使用水解探针的敏感性要比SYB