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中药蛇六谷石油醚萃取物对小鼠H22肝癌移植瘤抑制作用实验探究 　 作者：陈培丰 吴巧凤 倪桂宝 潘磊 徐国暑 【摘要】 目的］建立小鼠H22肝癌移植瘤模型，研究中药蛇六谷石油醚萃取物对其生长的抑制作用，并初步探讨其可能的作用机理。［方法］以皮下接种H22肝癌细胞的荷瘤小鼠为模型，进行蛇六谷不同提取物的体内抑瘤实验，观察抑瘤率、与5Fu的协同抑瘤作用；流式细胞仪检测蛇六谷石油醚萃取物对小鼠H22肝癌细胞凋亡的影响；免疫组织化学方法检测蛇六谷石油醚萃取物对荷瘤小鼠H22肝癌细胞生存素（Survivin蛋白）、Bcl2相关蛋白X(Bcl2 associated protein x，Bax蛋白)表达的影响。［结果］蛇六谷石油醚萃取物对小鼠H22肝癌移植瘤的生长具有一定的抑制作用，其机理可能与降低小鼠H22肝癌移植肿瘤Survivin蛋白的表达、上调Bax蛋白的表达，从而促进H22肝癌细胞凋亡相关。 【关键词】 蛇六谷；H22肝癌细胞；抑瘤率；凋亡；Survivin蛋白；Bax蛋白　　中药蛇六谷是天南星科魔芋属（Amorphophallus）的多年生草本植物的统称，又名魔芋。据《中药大辞典》［1］记载：本品性寒味辛、苦，内服有化痰消积、解毒散结、行瘀止痛的功效。现代广泛用治各种恶性肿瘤，有软坚散结、解毒抗癌作用，在肿瘤转移时，往往更重用该药并取得明显的疗效。前期实验结果显示，蛇六谷提取物对体外培养的人胃癌SGC7901细胞［1］、肝癌HepG2细胞和大鼠胶质瘤C6细胞均有较强的抑制增殖作用，且其机理可能与肿瘤细胞周期阻滞和诱导肿瘤细胞凋亡相关。本实验将系统溶剂法初步提取分离的蛇六谷石油醚萃取物进行体内抑瘤实验，研究其体内的抑瘤作用，并探讨其抗肿瘤作用的可能机理。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 （1）实验材料：蛇六谷，购自浙江中医药大学附属第一医院中药房，产地为浙江临安，经该院徐锡山主任药师鉴定为天南星科（Araceae）魔芋属花魔芋（Amorphophallus Konjac K.Koch）的干燥块茎。5氟尿嘧啶/Fluorouracil：10ml：0.25g，江苏南通精华制药有限公司，批号060602。（2）细胞株：人肝癌H22细胞株，购自中国科学院上海细胞生物学研究所。（3）实验动物：昆明种小鼠，雄性，体重18～22g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，许可证号：SCXK（沪）20030003。（4）主要仪器：SHZD（Ⅲ）循环水式真空泵、SENCO R201旋转蒸发仪、AR2130电子精密天平、DGG9070A电热恒温鼓风干燥箱、滩片机HI1210、轮转式切片机RM2135、石蜡切片刀架RM2135、切片漂烘温控仪QPB2、隔水式恒温培养箱37℃GNP9050型、EPICS XL型流式细胞仪、OLYMPUSBX50显微镜等。（5）实验试剂：碘化丙啶(PI)：杭州昊天生物技术有限公司（进口分装）；Annexin VFITC试剂盒：南京博泰生物技术有限公司；兔二步法检测试剂盒、SURVIVIN免疫组化试剂盒、BAX免疫组化试剂盒：北京中杉金桥生物技术有限公司；多聚赖氨酸（10x）：北京中杉金桥生物技术有限公司；乙醇、石油醚、乙酸乙酯等均为分析纯。 　　1.2 方法 　　1.2.1 蛇六谷石油醚萃取物的制备和配置：参考文献方法［2］，精密称取干燥的蛇六谷饮片200g，粉碎成粗颗粒，95％乙醇浸泡过夜后回流提取。提取液减压浓缩，回收乙醇后以石油醚萃取，回收萃取试剂后得石油醚萃取物，提取成分过滤除菌，浓缩至浸膏，得蛇六谷石油醚萃取物。 　　1.2.2 人肝癌H22细胞株的培养和制备：细胞悬液的制备采用RPMI1640完全培养基，置于37℃、5％CO2培养箱内，取对数生长期的细胞，用0.25％胰蛋白酶(含0.01%EDTA)消化，制成细胞悬液0.1ml，含细胞数1×106个，台盼蓝测定细胞活力在95%以上。 　　1.2.3 小鼠荷H22肝癌移植瘤模型的建立：参考文献方法［3］，H22肝癌细胞株腹水在小鼠体内传代3次，取腹水（乳白色）适量用PBS液以1∶4稀释混匀制成癌细胞悬液，调整癌细胞浓度为1×107/ml，各取0.2ml癌细胞悬液接种在昆明种小鼠右前腋皮下。接种24h后，随机分为5组：空白对照组，阳性对照组，蛇六谷石油醚萃取物高剂量组、中剂量组、低剂量组，每组各10只。于第二天开始灌胃给药，中药各组给药体积均为0.2ml/10g体重，空白对照组予0.2ml/10g体重的蒸馏水，阳性对照组予0.2ml/10g体重的5Fu（25mg/kg）液，药物合用组予0.2ml/10g的石油醚萃取物高剂量的药物和0.2ml/10g的5Fu液。并每天在灌胃前定时称体重，连续10d。第11天时，称体重，然后用脱