中药联合褪黑激素对帕金森模型大鼠前脑纹状体细胞凋亡及行为学.docVIP

中药联合褪黑激素对帕金森模型大鼠前脑纹状体细胞凋亡及行为学 　 作者：严丽荣 周亚平 苗曼悌 王林仙 徐金 张晔 周志强 刘益仁 狄荣科 【摘要】 目的 观察中药(平颤方)联合褪黑激素（MT）对帕金森病(PD)模型大鼠行为学和前脑纹状体细胞凋亡的影响，探讨中药联合MT治疗PD的作用及其机制。 方法 SD大鼠60只，分5个组：空白对照组、模型对照组、MT组、中药组、中药+MT组。模型对照组和各治疗组大鼠腹腔注射N甲基4苯基1，2，3，6四氢吡啶（MPTP）建立PD模型，用爬杆法和迷宫试验测量大鼠行为学改变和智力状况，Bax/Bcl2免疫组织化学染色和Tunel法检测前脑纹状体凋亡细胞。 结果 PD大鼠出现不同程度爬杆能力下降和智力减退；与病理对照组相比，用药实验组尤其是中药+MT组大鼠行为学异常可部分或全部改善（P＜0.05），前脑纹状体神经元和胶质细胞Bcl2蛋白表达明显增强（P＜0.01），Bax基因表达受抑制（P＜0.01），同时前脑黑质纹状体通路细胞凋亡减少（P＜0.01）。结论 中药平颤方联合MT通过抗氧化应激途径，激活Bax/Bcl2系统，调节前脑黑质纹状体通路多巴胺（DA）神经活性，抑制细胞凋亡和改善PD症状。 【关键词】 中药平颤方；褪黑激素；N甲基4苯基1,2,3,6四氢吡啶；细胞凋亡；帕金森病 帕金森病(PD)在中医学中属于“颤证、颤振”范畴，中老年人肝肾亏虚，髓海不足，虚风内动是本病发病之源〔1〕。临床应用左旋多巴替代内源性多巴胺(DA)的缺乏，可改善PD症状，但大多数病人服药一段时间后疗效减退，出现运动障碍、智力减退和精神症状等副作用。根据中医对PD的认识并结合临床经验拟定中药平颤方，观察中药联合褪黑激素（MT）对前脑纹状体细胞凋亡的影响及功能的改善，探讨其联合治疗PD的作用及机制。 　　1 对象与方法 　　1.1 对象 　　雄性SD大鼠，体重255～305 g（鼠龄6～8 w），由江苏大学医学院实验动物中心提供。动物自由进食饮水，光照12/12 h明暗交替，室温饲养。用爬杆法进行筛选：引导动物在10 s内自杆顶爬至杆底，每只训练4次，训练完毕对其进行测定，选取正常（0分）大鼠进入实验，随机抽取12只作空白对照组，其余作建模处理。将MPTP用生理盐水配制，浓度为30 mg/ml，30 mg/kg腹腔注射，每日1次，共7 d。再用爬杆法进行筛选，筛选48 只PD模型(1.5～2.0分)大鼠进入实验；随机抽取36只作为治疗组（中药组、MT组、中药组+MT组，每组12只），其余12只作模型对照组。总共入选大鼠60只，每组均为12号。 　　1.2 方法 　　各治疗组和模型对照组大鼠于末次注射MPTP及用药/水后7、14、21 d，进行爬杆试验，每只大鼠允许爬杆3次，计算平均分。爬杆实验用直径35 mm、高1 000 mm的光滑不锈钢管，垂直竖立，将大鼠头向下放置在金属杆的顶部，使其沿杆自然爬下，观察动物在下行过程中的行为，并按标准计分，评分标准如下：四肢并用，一次顺利从杆上爬下为0分；一步一步螺旋向下爬行但兼有后肢滑行行为的为0.5分；上杆后间歇停顿数次后爬下，但可抱紧金属杆为1分；滑行后掉落为1.5分；不能抓杆，直接掉落为2.0分。同时对所有动物进行“T”形迷宫实验，测定动物智力状况，每只大鼠走迷宫3次，计算平均错误次数。 　　1.2.1 中药配方及治疗 　　中药平颤方由黄芪、天麻、银杏叶、白芍、钩藤、连翘、生甘草、野生葛根、大叶红景天、黄连等组成，制成浓缩煎剂。每日20:00胃饲中药除平颤方煎剂3 ml（相当于中药10 g），同时腹腔注射MT 10 mg/kg，连续治疗21 d；模型对照组，每日同时胃饲3 ml生理盐水和腹腔注射1 ml生理盐水。MT（Sigma公司产品）使用前先用无水乙醇溶解，然后加生理盐水稀释，MT初始浓度为3 mg/L,使用前调至所需终浓度，其中无水乙醇浓度小于0.5％(V/V)。 　　1.2.2 取材和切片制备 　　各组动物分别于末次注射MPTP后用药/生理盐水治疗7、14、21 d,用10%水合氯醛麻醉，0.9%生理盐水150 ml经心脏快速灌注冲洗，再用4.0%多聚甲醛200 ml灌注。取右侧半脑，10%甲醛固定48 h以上。以松果体为标志，向头侧横向切取3段，每段厚2 mm，前段为纹状体最大分布区。石蜡包埋，连续切片，片厚5 μm，取4套切片，分别用于HE染色，Bax/Bcl2免疫组织化学染色和Tunel法细胞凋亡染色。 　　1.2.3 Bax/Bcl2免疫组织化学染色 　　采用SP法，兔抗鼠Bax、Bcl2抗体及生物素羊抗兔IgG（购于武汉博士德生物技术公司）。切片脱蜡后，用3%甲醇过氧化氢孵育20 min，将切片置于10%牛血清蛋白30 mi