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β分泌酶原核表达载体构建、表达及融合蛋白纯化 　 作者：朱爱华 李敬 陆军 钱进 郑元林 【摘要】 目的 构建小鼠β分泌酶原核表达载体并诱导其表达和纯化，为进一步研究β分泌酶的作用奠定基础。方法 根据基因文库中小鼠β分泌酶基因的cDNA序列设计引物，采用RTPCR方法扩增到β分泌酶的cDNA片段，克隆进原核表达载体pET28a中，并转化大肠杆菌BL21(DE3)，测序鉴定后，通过IPTG诱导表达出目的蛋白，经亲合层析纯化。结果 从小鼠的脑组织RNA中扩增出特异的β分泌酶基因片段长1 506 bp，经酶切鉴定及DNA序列测定，证实重组载体pET28aBACE构建正确，表达融合蛋白分子量约为55 kD，经镍离子亲合柱层析纯化获得电泳级纯度的目的蛋白。结论 在大肠杆菌中获得了小鼠β分泌酶的高效表达，为进一步研究其生物学功能和应用奠定了基础。 【关键词】 β分泌酶；大肠杆菌；表达；融合蛋白 【Abstract】Objective To build mice β secretase prokaryotic expression vector and induce its expression and purification, to afford basis for β secretase research. Methods Primer was designed by mice β secretase gene cDNA in Genbank. cDNA segment of β secretase gene was amplified by RTPCR, then cloned into prokaryotic expression vector pET28a and transformed into E. coli BL21(DE3). After sequenced and identified, fusion protein was induced, expressed and purified.Results Special β secretase gene segment amplified from RNA of mice brain tissue was 1 506 bp. After identified and sequenced, recombinant vector was proved correct, its fusion protein had a molecular weight of 55 kD. Electrophoresis purity target protein could be acquired. Conclusions Mice β secretase has a high expression in E. coli, which build a basis for research of β secretase′s biological function and its application. 【Key words】βsecretase; E. coli; Expression; Fusion protein 　　阿尔茨海默病(AD)是发病率最高，危害最大的中枢神经系统退变性疾病〔1〕。淀粉样斑块是其主要病理特征之一，主要成分β淀粉样蛋白(Aβ)在AD的发生、发展中起着重要作用，因此阻断或延迟AD早期Aβ的积聚成为治疗AD的切入点。β分泌酶(BACE)是淀粉样前体蛋白(APP)水解产生Aβ的关键酶，是干预AD进程的理想靶点〔2〕。通过酵母或昆虫表达系统表达活性BACE在最近已见报道。然而，由于上述系统表达的蛋白量低，不适合BACE抑制剂的大规模筛选〔3，4〕。而BACE的原核表达可克服以上缺陷，为筛选特异性抑制剂及研究BACE结构与功能关系提供大量材料，为最终从根本上治疗AD带来希望。本研究利用大肠杆菌表达系统，选用pET28a作为表达载体获得小鼠BACE，经镍离子固定金属亲和层析纯化目的蛋白，以便进一步研究其功能。 　　1 材料与方法 　　1.1 主要材料 　　2月龄昆明小鼠(购自徐州医学院)；宿主菌E.coli BL21(DE3)(由本实验室保存)；质粒pET28a(购自Novagen公司)；限制性核酸内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ、T4 DNA连接酶等工具酶(购自大连宝生物工程公司)；Trizol 试剂及AMV逆转录酶(美国Promega公司)；Pfu DNA聚合酶及溶菌酶(上海生工生物工程公司)；PCR纯化和胶回收试剂盒(购自上海华舜生物工程公司)；DNA marker、中分子量蛋白质marker是 Fermentas公司产品；镍离子亲合层析柱(Novage