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Id3基因在心肌营养素1促心肌成纤维细胞增殖中作用 　作者：周瑞红 李菊香 夏子荣 颜素娟 谭秋波 【摘要】 　　目的 探讨在高静水压条件下分化抑制因子3（inhibitory of differentiation 3，Id3 )基因在心肌营养素1 (cardiotrophin1，CT1 ) 促心肌成纤维细胞增殖中的作用。方法 3～4代心肌成纤维细胞用于实验，分为对照组( C 组)、CT1反义寡核苷酸组 (ASODN组) 、 正义寡核苷酸组 ( SODN组)、高静水压组( P 组)。利用自制压力培养装置，将各组细胞置于160 mmHg压力下培养8 h。CT1活性通过 Western印迹法分析测定，Id3基因表达通过RTPCR方法测定，MTT测定心肌成纤维细胞增殖 。结果 高静水压明显促进心肌成纤维细胞增殖 ，CT1表达上调，Id3 mRNA表达增加；CT1 ASODN干预后能抑制高静水压所致的细胞增殖，CT1表达下调，Id3 mRNA表达减少。结论 Id3 mRNA在心肌成纤维细胞中有明显表达，且与CT1促心肌成纤维细胞增殖密切相关。 【关键词】 心肌营养素1 ；心肌成纤维细胞 ；分化抑制因子3 　　近年有研究发现心肌营养素1 ( CT1 )与高血压心室重塑有一定的关联，在12周龄的自发性高血压大鼠(SHR)的肥厚心室肌中，CT1 mRNA明显升高〔1〕。另有研究发现，内源性或外源性的CT1能刺激成纤维细胞合成DNA及胶原，促进成纤维细胞生长〔2〕 。分化抑制因子（Id）3作为血清诱导的立即早期基因在小鼠成纤维细胞系中被首次发现，其基因由3个外显子和2个内含子组成〔3〕。Id3参与多种细胞生物学过程，包括骨骼肌的分化、血管平滑肌的增殖、胚胎的神经形成、骨和血管发生等〔4～7〕，表明CT1与Id3均存在于成纤维细胞中，且都有促进细胞增殖的作用，但他们之间是否存在某种联系，Id3在心肌成纤维细胞中的表达情况及 CT1促心肌成纤维细胞增殖的作用是否与Id3有关尚未见报道。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　出生1～3 d的SD乳鼠(南昌大学医学院医学实验动物科)；RTPCR试剂（Promega，USA）；Trizol( Invitrogen，USA)；DEPC，二甲基亚砜（DMSO)（Ameresco，USA）； DL2000 DNA Ladder Marker (上海生工) ；MTT增殖检测试剂盒(Sigma，USA) 。 　　1.2 方法 　　1.2.1 心肌成纤维细胞的原代培养及鉴定 　　在无菌条件下摘取4～5只大鼠心脏， 分离心室利用蛋白酶消化心肌组织， 差速贴壁法获得原代心肌成纤维细胞。第 3～4代细胞用于实验。鉴定方法参照文献〔9〕。 　　1.2.2 CT1反义链与正义链的设计与合成 　　以硫代磷酸修饰反义和正义寡核苷酸链，由上海生物工程有限公司合成，各自序列为：CT1反义寡核苷酸链(ASODN)：5′TGGCTCATGCTGGCCCCAGGCTGAT3； CT1正义寡核苷酸链(ASODN)：5′ATCAGCCTG′GGGCCAGCATGAGCCA3′。 　　1.2.3 实验分组及干预措施 　　①空白对照组(C) ：大气压下培养； ②高静水压组(P) ：160 mmHg 压力下培养8 h〔9〕；③CT1反义寡核苷酸组(ASODN组)：160 mmHg压力培养下，加入终浓度为10 μmol／L的ASODN；④CT1正义寡核苷酸组(SODN)：160 mmHg 压力培养下8 h，加入终浓度为10 μmol／L的SODN。 　　1.2.4 RTPCR法检测Id3 mRNA 的表达 　　按照Trizol试剂说明书提取心肌细胞总RNA。参照Promege公司提供的RTPC试剂盒说明书进行逆转录反应， PCR反应共35个循环。引物设计由 Gen Bank中获取目的基因全序列，借助primer primier 5.0软件设计完成，由上海生工合成，各引物序列（含参照序列①和目的序列②）见下 ：①βactin正义5′GTAAAGACCTCTATGCCAACA3′；反义5′ACTCATCGTACTCCTGCTTG3′,240 bp。②Id3正义5′CATCTCCCGATCCAGACA3′；反义5′TCATAATCAGGGCAACAGAG3′；494 bp。 　　1.2.5 蛋白表达的检测 　　Western 印迹法检测细胞裂解液中CT1蛋白表达情况，用 Lab Work 3.0 UVP软件分析条带的积分吸光度值， 相对蛋白含量用积分吸光度值表示。 　　1.2.6 心肌成纤维细胞增殖检测( MTT法) 　　在各种条件培养下的96孔板实验结束前4 h ，每孔