六味地黄丸增强黑色素瘤自杀基因系统旁观者效应体外探究.docVIP

六味地黄丸增强黑色素瘤自杀基因系统旁观者效应体外探究 　　　【摘要】【目的】探讨六味地黄丸含药血清对单纯疱疹病毒核苷激酶/丙氧鸟苷(HSVtk/GCV)系统杀伤小鼠黑色素细胞瘤B16细胞株的增效作用,为提高临床基因治疗肿瘤疗效提供新思路。【方法】构建并鉴定恶性黑色素瘤B16细胞HSVtk/GCV治疗系统,制备六味地黄丸含药血清及对照血清,将B16、B16/tk细胞按20%(1∶4)的比例混合制成细胞悬浮液接种于96孔培养板上,分为对照血清组、含药血清组、对照血清联合GCV组、含药血清联合GCV组,其中含药血清组及含药血清联合GCV组按血清体积分数计又分高(10%)、中(5%)、低(25%)3组,GCV的终浓度为25μmol/L,按分组添加相应的含药血清,每孔培养液总体积200μL,37℃、体积分数5%的CO2培养箱培养。48h后采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测杀伤效应。采用金正钧Q值法分析六味地黄丸含药血清与自杀基因治疗系统联合作用对旁观者效应是否具有协同性。【结果】MTT实验表明联合用药组对B16细胞的抑制率明显高于其他组,六味地黄丸含药血清对B16细胞株HSVtk/GCV系统的增效作用存在量效关系：25%、5%、10%含药血清联合20%tk/GCV组的实际抑制率(4875%、5939%、6928%)显著高于理论抑制率(3813%、3867%、3992%),金正钧Q值分别为128、154、174,均大于115,具有协同增效作用。【结论】六味地黄丸含药血清对B16细胞株HSVtk/GCV系统旁观者效应有明显的增效作用,且具有一定的量效关系。 　　【关键词】六味地黄丸/药理学;自杀基因疗法;黑色素细胞/病理学;细胞培养 　　恶性黑色素瘤被选择作为肿瘤基因治疗的第一个临床试用目标,经过近20年的摸索已取得了长足的进展,其中自杀基因疗法以其独特的旁观者效应而备受青睐[1]。目前单纯疱疹病毒Ⅰ型核苷激酶(HSV1tk)自杀基因治疗转移性恶性黑色素瘤已应用于Ⅰ/Ⅱ期的临床研究[2],但仍存在转染效率低、靶向性不够、治疗载体的毒副作用等问题,使单纯自杀基因治疗难以完全治愈恶性黑色素瘤。联合治疗是提高自杀基因治疗疗效的方法之一。前期实验表明[3]滋阴补肾经典名方六味地黄丸对小鼠移植性恶性黑色素瘤自杀基因治疗具有增效作用,本研究拟通过体外实验进一步论证,在构建黑色素瘤B16细胞HSV1tk自杀基因治疗系统的基础上观察六味地黄丸对其旁观者效应是否具有增效作用,现将结果报道如下。 　　1材料与方法 　　11实验动物及细胞SD大鼠,体质量200～220g,雄性,健康,SPF级,广州中医药大学实验动物中心提供,合格证号：SCXK(粤)20030001,粤监证字：2007A024;小鼠恶性黑色素瘤细胞株B16购于中山大学动物中心细胞库。 　　12试剂及耗材细胞培养用RPMI1640粉和25g/L含乙二胺四乙酸(EDTA)胰酶为Gibco公司产品,新生牛血清为奥地利PAA公司产品,青、链霉素合剂为杭州吉诺生物医药技术有限公司产品,四甲基偶氮唑盐(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)、丙氧鸟苷(GCV)均为美国Sigma公司产品,细胞培养用培养板、培养瓶、培养皿、冻存管均为德国Greinerbioone公司产品,一次性微孔滤膜为美国Corning公司产品,2倍TapPCRMasterMix为天根生化科技(北京)有限公司产品,基因组DNA提取试剂盒为上海申能博彩生物科技有限公司产品,琼脂糖粉为美国Amresco公司产品,DNA凝胶电泳指示染料GoldView购自北京赛百盛生物工程技术有限服务公司。 　　13主要仪器BNA3210型CO2培养箱(日本Espec公司),JH型超净工作台(苏州净化设备厂),XDS1B型倒置显微镜(重庆COIC公司),680型酶标仪(美国BioRad公司),XYJ801型电动离心机(江苏省金坛市医疗仪器厂),318K型高速冷冻离心机(德国Sigma公司),JB1型磁力搅拌器(上海雷磁仪器厂新泾分厂),TP600型PCR仪(大连TaKaRa公司),DYY8C型稳流稳压电泳系统(美国BioRad公司),GenDoc1000型凝胶成像系统(美国BioRad公司),IX71F22FL/PH型图像采集系统(日本Olympus公司),80210398型紫外分光光度计(英国PharmciaBiotech公司)。 　　14恶性黑色素瘤细胞HSVtk/GCV治疗系统的构建与鉴定 　　141恶性黑色素瘤细胞HSVtk/GCV治疗系统的构建取PT67/tk细胞病毒上清液感染对数生长期的B16细胞,G418抗性筛选阳性克隆命名为B16/tk并扩大培