供者未成熟树突状细胞联合西罗莫司诱导大鼠皮肤移植物免疫耐受探究.docVIP

供者未成熟树突状细胞联合西罗莫司诱导大鼠皮肤移植物免疫耐受探究[摘要]目的：观察大鼠骨髓来源的未成熟树突状细胞(imDCs)联合西罗莫司(SRL)在诱导大鼠同种异体皮肤移植免疫耐受中的协同作用。方法：以雄性Lewis大鼠为供者、Brown-Norway大鼠为受者，建立大鼠同种异体皮肤移植模型。对照（control）组术前不给予任何干预；未成熟树突状细胞(imDCs)组于术前7天经尾静脉注射供者骨髓来源的未成熟树突状细胞；西罗莫司(SRL)组于术后连续7天经胃管灌注西罗莫司；联合(imDCs+SRL)组于术前7天经尾静脉注射供者骨髓来源的未成熟树突状细胞，并于术后连续7天经胃管灌注西罗莫司。结果：对照组、未成熟树突状细胞(imDC)组、西罗莫司(SRL)组、联合(imDCs+SRL)组大鼠同种异体皮肤移植物术后存活时间分别为(8.25±1.75)、(10.25±1.91)、(10.64±2.50)、(21.38±2.97)天。方差分析提示组间差异有统计学意义(P＜0.05)；S-N-K检验提示除单独应用未成熟DC组与单独应用SRL组外，各组间的差异均有统计学意义(P 1.3 大鼠异体皮肤移植模型：以BN大鼠为供体，LEW 大鼠为受体。供体腹腔内注射50mg／kg戊巴比妥钠麻醉，于其躯干背部以剪去全层皮肤一块，刮尽皮肌，修剪成中厚皮，制成直径1cm的圆形皮片，修剪成中厚皮；受体同样方法麻醉后，背部胸腹交界处剃毛，皮肤消毒，用眼科剪刀以钳夹法剪去全层皮肤一块，形成约1cm2的圆形创面，勿伤及皮肌。将供者皮肤贴于创面处，间断缝合皮肤边缘，打包包扎，注意移植皮片毛的方向与受者毛的方向相反。5天后打开包扎，观察皮片的存活情况，皮片变黑坏死脱落或全部形成干痂为皮片死亡。移植术前对LEW大鼠肌肉注射青霉素钠2万U／kg；术后再注射1万U／kg，2次／天，共3天。 1.4 实验分组设计：随机将32只LEW 受体大鼠分为4组(每组8只)，32只BN供体大鼠分为4组(每组8只，对应分配于3组受体移植大鼠)。①对照(control)组：术前不给予任何干预措施；②未成熟树突状细胞(imDCs)组：于术前7天经尾静脉注射供者骨髓来源的imDCs 2×106个/只；③西罗莫司(SRL)组：于术后连续7天经胃管灌注SRL 3mg.kg-1.d-1；④联合(imDCs+SRL)组：使用imDCs于术前7天经尾静脉注射，术后连续7天经胃管灌注SRL，用法同imDCs组及SRL组。 1.5 移植皮片病理学观察及排斥反应分级：于移植术后第7天分别取各组大鼠的移植皮片，用40g/L的多聚甲醛液固定，常规石蜡包埋组织，切片后HE染色，光镜下观察皮片病理变化。镜下皮片的排斥反应分级参照文献[9]的分级标准。 1.6 统计学方法：采用统计学软件SPSS 13.0，以方差分析检验各组均数问的差异，如果差异有统计学意义，S-N-K检验进一步行多重比较。 2结果 2.1 未成熟DC形态学检测：未成熟DC培养24h后，光镜下可见贴壁的单核细胞均匀分布。3天后大量的细胞疏松的贴附于板壁上呈簇状生长。5天后细胞集落增多，呈悬浮生长，细胞形态不规则，表面有星状毛刺疏松粘附细胞即为未成熟DC。 2.2 移植皮片病理学观察：各组移植术后第7天移植物排斥反应分级。①对照（control）组：镜下观察，移植皮片表皮层断裂，腺体结构消失，大量炎性细胞浸润，分级为Ⅳ级；②未成熟树突状细胞(imDCs)组和西罗莫司(SRL)组：移植皮片皮下组织有出血，腺体结构不完整，但炎症细胞浸润较对照组明显减轻，分级为Ⅲ级；③联合(imDCs+SRL)组：皮片各层结构及皮肤附属器形态完整，少量炎性细胞浸润，分级为Ⅱ级。联合使用imDCs及SRL可降低移植物排斥反应等级。 2.3 各组移植皮片生存时间(见表1):各组间差异具有统计学意义。control组8天左右移植皮片完全坏死脱落，imDCs组以及SRL组情况相似，7天左右皮肤出现局部溃疡，10天左右移植皮片完全坏死，而imDCs+SRL组在7天时皮片成活较好，在2周左右皮片出现溃疡，在3周左右移植皮片才形成干痂、坏死脱落。对照组与imDCs组、SRL组和imDCs+SRL组的移植皮片生存时间存在显著差异（P＜0.05）；imDCs组与SRL组的移植皮片生存时间无显著差异（P=0.74）；imDCs+SRL组与imDCs组、SRL组的移植皮片生存时间存在显著差异（P＜0.05）。以上数据说明未成熟DC联合应用SRL可显著延长移植皮片的存活时间。 3讨论 皮肤移植后的免疫排斥反应是典型的细胞性排斥反应，成熟DC表面表达丰富的MHC分子和辅助刺激因子，能有效地递呈抗原并激活T细胞发生免疫应答，而