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人胚胎脊髓背根雪旺氏细胞培养[摘要] 目的 探索人胚胎雪旺氏细胞的分离、培养和纯化的方法，为将来雪旺氏细胞移植奠定基础。 方法 从胎儿脊髓背根中分离培养雪旺氏细胞，利用雪旺氏细胞与纤维母细胞的不同贴壁特性，综合利用酶消化、时间差和阿糖胞苷抑制等方法，达到分离和纯化人雪旺氏细胞的目的。 结果 雪旺氏细胞大部份呈梭形，两端有突起，少数呈多角形。 免疫组化示这些细胞呈S-100抗原阳性，细胞纯度达99%。 结论 本方法分离、培养的人雪旺氏细胞纯度高，是一种有效的培养方法。 [关键词] 雪旺氏细胞；培养；人 [中图分类号] R421 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2012）06（a）-0025-02 雪旺氏细胞（SCs）是周围神经系统中一种功能特殊的胶质细胞，是周围神经中神经鞘的主要组成部分。近年来发现，SCs不仅能维持周围神经正常的电生理传导功能，还在神经损伤后修复再生过程中起重要的作用[1]。研究表明[2]，SCs在周围神经损伤后的修复过程中，主要是通过分泌多种神经生长因子，维持神经元的存活；另一方面，SCs还通过产生细胞外基质、细胞黏附分子等，在神经轴突的再生过程中起支持和引导的作用。利用SCs的这种特性，将SCs作为一种支持细胞移植到中枢神经系统上，在神经系统损伤修复中发挥巨大的作用[3]。作为细胞移植前的基础工作，本实验探讨从人胚胎脊髓背根中分离、培养并纯化人SCs。 1 材料与方法 1.1 材料与试剂 DMEM细胞培养基（Gibco公司），胎牛血清（FBS，杭州四季青公司）；0.125%胰蛋白酶-EDTA（Gibco公司）；胶原酶（Sigma公司）；Forskolin、牛脑垂体提取液（BT1，Sigma公司），阿糖胞苷（Sigma公司），D-Hanks平衡液，CO2培养箱（NAPCO公司），倒置相差显微镜（Olympus公司），35 mm一次性培养皿，多聚赖氨酸，兔抗人S-100（Neomarkers公司）；即用型SABC免疫组化试剂盒和褐色DAB显色试剂盒，均购自博士德公司；引产的28周死亡胎儿（汕头大学医学院第一附属医院妇产科提供）。 1.2 雪旺氏细胞的分离和培养 从引产的28周胎儿中分离背根神经，将背根神经在D-Hanks平衡液中切成小块，在37℃下加入胶原酶进行消化约1 h，后加入等量含10%胎牛血清、青酶素和链酶素的DMEM溶液中止消化。800 r/min离心5 min，移除上清，加入2 mL的DMEM，用火焰抛光的吸管进行吹打，将吹打后的细胞悬液用微孔大小约10 μm的滤网进行过滤，制成单细胞悬液。将单细胞悬液移入用多聚赖氨酸包被的培养瓶中，置摇床上每隔10 min 摇10 s，总共摇30 s，将雪旺氏细胞与混杂在其中的成纤维母细胞进行分离。将上层的细胞悬液移入另外一个培养瓶中进行培养，原培养瓶中底部沉淀的成纤维母细胞和少量的雪旺细胞加入10 mL的DMEM进行培养，约4 h后，原培养瓶再进行震摇，将悬浮细胞移入另一培养瓶中进行培养，原培养瓶中余下的细胞大部份为成纤维母细胞。将上述方法取材、消化、纯化后的细胞悬液种植于含20%FBS的DMEM培养液中，于5%CO2，37℃条件下培养24 h后，更换成含阿糖胞苷（终浓度为5 μg/mL）和20% FBS的DMEM培养液，48 h左右更换成含有Forskolin及BT1生长促进剂的培养液，每周2～3次。待细胞长满皿底后以0.125%的胰蛋白酶-EDTA液消化1～2 min，同时镜下观察，当细胞开始皱缩后加入含血清培养液中止消化，离心（1 500 r/min，5 min），加入适量培养液，用抛光的吸管吹打，稀释后接种在预先涂布有多聚赖氨酸的35 mm培养皿中。静置5～15 min，吸出上清液，离心（1 500 r/min，5 min），加适量培养液， 用抛光的吸管吹打，均匀后重新接种于另一只预先涂布多聚赖氨酸的35 mm培养皿中，于5% CO2，37℃条件下培养。 1.3 S-100免疫组化法鉴定SCs及纯度 反复传代后，待P4代SCs长满底部后，以3%甲醛固定10 min，PBS冲洗3次。加入一抗兔抗人S-100多克隆抗体（1∶100），4℃过夜；0.1 mol/L PBS冲洗3次，滴加生物素化山羊抗兔IgG，20～37℃ 20 min，0.1 mol/L PBS漂洗2 min×3次；滴加试剂SABC，20～37℃ 20 min，0.1 mol/L PBS漂洗5 min×4次；DAB（用蒸馏水1 mL加试剂盒中A，B，C试剂各1滴），室温下显色5～30 min。显微镜下观察，S-100阳性细胞为SCs。细胞纯度采用抽样法进行统计。该方法大略如下：用一带网格的盖玻片在显微镜下对S100抗原阳性细胞（雪旺