DOC-1基因原核表达载体构建及其重组蛋白表达纯化.docVIP

DOC-1基因原核表达载体构建及其重组蛋白表达纯化[摘要]目的：克隆DOC一1基因、构建原核表达载体并纯化出其重组蛋白。方法：从人胎脑组织中提取总RNA，经逆转录－聚合酶链式反应(RT―PCR)扩增DOC－1的CDS序列，再通过基因重组技术将该基因片段依次克隆到pMD18-T和pGEX-4T-1载体中，构建融合表达载体pGEX-4T-1-DOC-1，经酶切、测序鉴定后，用该重组质粒转化E.coliBL21，用IPTG诱导表达，OlutathioneSepharose 4B柱亲和层析纯化重组蛋白。结果：电泳证实RT-PCR扩增产物与预期目的基因DOC－1长度一致，测序结果与GenBank公布的DOC－1基因序列完全一致，IPTG诱导后经SDS―PAGE电泳分析表明，在相对分子质量38000左右出现新的蛋白表达条带，经亲和层析柱纯化后得到高纯度的GST-p12重组蛋白。结论：成功构建了pGEX-4T-1－DOC－1原核表达载体，表达并纯化出GST－p12重纽蛋白，为进一步研究p12DOC-1蛋白打下了实验基础。 [关键词]p12DOC-1；蛋白；口腔癌缺失；基因克隆；基因表达 [中图分类号]Q813.1 [文献标识码]A [文章编号]1008－6455(2007)04―0447―03 癌症作为一类严重威胁人类生命的疾病，已成为医学研究关注的重要课题。口腔癌和身体其他部位癌一样，其发生、发展亦涉及癌基因的激活和抑癌基因的失活。DOC－1基因是Todd等(1995)利用叙利亚仓鼠口腔颊癌模型分离的正常和恶性角化细胞进行细胞杂交实验分离和证实的一个候选抑癌基因，作为一个候选抑癌基因它具有以下几个特点：恶性角化细胞杂合性缺失；与正常上皮相比恶性上皮中DOC－1表达降低；DOC－1的转入抑制肿瘤细胞的生长；经转染DOC－1 cDNA的恶性角化细胞在动物模型中逆转了恶性表型。p12蛋白作为其编码的蛋白因子，具有抑制DNA复制，从而抑制恶性角化细胞的生长，使其表型改变的功能，近来已逐渐成为研究的热点。为了开展对DOC－1的研究，进一步了解其功能及其在口腔鳞状细胞癌中表达缺失机制中的作用，本实验通过RT―PCR获得DOC－1的eDNA编码区序列，并且构建了其克隆表达载体，在大肠杆菌中实现了p12DOC－1重组蛋白的高表达，为以后的工作打下了实验基础。 1　材料 1．1　质粒、菌株和标本：pMD18-T和pGEX-4T-l载体质粒、E.coli (DH5 a和BL21)、7个月的人胚胎脑组织，均由中科院遗传与发育生物学研究所戴建武实验室惠赠。 1．2 工具酶和试剂盒：各种限制性核酸内切酶、T4DNA连接酶、T载体试剂盒、TaqDNA聚合酶、M-MLV反转录酶、O1igo(dT)均购自Takara公司，IOObpDNA ladder marker购自北京天为时代生物公司，蛋白分子量marker购自fermentas公司。总RNA提取试剂盒TRIZOL购自Invitrogen公司。质粒DNA提取试剂盒、胶回收试剂盒、PCR产物纯化试剂盒均购自OMEGA公司。 1．3 试剂及引物合成：一般化学试剂均为国产分析纯，Glutathione Sepharose 4B购自AmershamBiosciences公司。PCR引物合成及测序均由上海生工生物技术有限公司完成。 2　方法 2．1　RT―PCR扩增DOC－1基因及基因重组与鉴定：按TRIZOL试剂盒说明提取7个月人胚胎的脑组织的总RNA，先反转录为cDNA，再以此为模板进行PCR，上下游引物分别为5ATGTCTTACAAACCGAACTTGGCC3’和5CTAGGATCTGGCATTCCGTTC 3’。反应体系共25μl，扩增程序：94℃ 5min；94℃ 40s；56℃ 40s；72℃ 50s；共循环34次；最后在72℃维持10min。取5μl反应产物进行1.2％的琼脂糖凝胶电泳，鉴定扩增产物；回收相应大小的PCR产物后与pMDl8-T载体连接，转化大肠杆菌(DH5a)感受态细胞，构建pMDl8-T-DOC-1载体质粒。用菌落PCR进行初步鉴定，将能扩增出目的基因片段的质粒送上海生物工程公司测序。 2．2 原核表达载体pGEX-4T-1-DOC-1的构建：以测序后含DOC-1编码区序列的质粒为模板，在前一对引物的基础上再分别设计含酶切位点的上下游引物分别为5CGCCGGTCCATGTCTTACAAACCG3’和5CCGCTCGAGCTAGGATCTGGCATT3’，其中上游含BamH Ⅰ酶切位点，下游含Xho Ⅰ酶切位点，扩增含有酶切位点的DOC-1编码区序列。回收并纯化PCR产物后用BaraH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切，表达载体pGEX-4T-1也