EGFP-Arg7融合蛋白表达及在HeLa细胞中转导活性.docVIP

EGFP-Arg7融合蛋白表达及在HeLa细胞中转导活性摘要：目的构建pET-28a-EGFP-Arg7重组子，观察表达的融合蛋白EGFP-Arg7在细胞内的转导活性。方法构建EGFP-Arg7(阴性对照为EGFP)序列，与pET-28琏接后。转化EcoliBL21(DE3)，IPTG诱导表达，并经Ni2+-NTA纯化。纯化产物作用于HeLa细胞后用荧光显微镜观察其转导活性。结果重组pET-28a-EGFP-Arg7经酶切鉴定和序列分析，证明构建正确。转化EcoliBL21(DE3)后，重组蛋白获得可溶性表达。纯化后的融合蛋白纯度达90％以上。重组蛋白EGFP-Arg7作用于HeLa细胞后用荧光显微镜可观察到强绿色荧光。结论Arg7具有很好的转导活性，能携带与其连接的蛋白质穿过HeLa细胞膜。 关键词：多聚精氨酸；蛋白转导域；HeLa细胞 中图分类号：R966 文献标识码：A 文章编号：1672－979X(2010)05－0158－04 蛋白转导域(protein transduction domain，PTD)是一类能携带其它生物大分子(蛋白质、多肽等)穿过多种哺乳细胞膜的短肽。由PTD介导的蛋白跨膜过程称为转导。蛋白转导现象最初是通过研究HIV-1的反式激活蛋白(TAT，47～57位氨基酸)发现的，目前已发现十多种小肽具有携带外源蛋白进行跨膜转运的功能。研究发现，许多蛋白转导域序列中均富含精氨酸(Arg)和赖氨酸(Lys)，因带有高强度正电荷，能够迅速与细胞膜结合，通过内吞等方式实现穿膜转运。 多聚精氨酸型蛋白转导域是根据PTD的结构特点而设计的一种穿膜肽。文献报道其转运效率高于HIV来源的TAT PTD，且转导效率随精氨酸数不同而有所差别。本研究以EGFP(enhanced green fluorecence protein)作为报告蛋白与7聚精氨酸(Arg7)连接，以观察Arg7的转导活性。EGFP是一种优化的突变型绿色荧光蛋白，其荧光比野生型强35倍，具有结构稳定、高效表达特点，适用于细胞基因表达、蛋白质定位检测及细胞示踪标记。 1　材料 pET-28a质粒、E.coli BL21(DE3)、质粒EGFP，HeLa细胞株由本实验室保存；T4DNA连接酶、BamHI、Nde I和IPTG、质粒DNA小量纯化试剂盒均购自TaKaRa公司；引物合成及DNA测序由上海生物工程公司完成。 2　方法 2.1引物设计、PCR扩增及重组原核表达质粒的构建 根据BGFP编码序列设计EGFP-Arg7的PCR引物。引物1:5－AAACATATGGTGAGCAAGGGCGAGG－3，划线部分为Nde I限制性酶切位点；引物2:5－AAAGGATCCTTAACGACGACGACGACGACGACGACCACCC TTGTACAGCTCGTC－3，划线部分为BamH I限制性酶切位点。引物由上海生工生物工程技术服务公司合成。PCR反应体系组成为10uL PCR-Mix，1uL引物1，1uL引物2，1uL pET－28a－EGFP，ddH2O补足至20uL。PCR反应条件：97℃预变性5min进入循环，94℃30s，58℃30s，72℃1min，35个循环，然后72℃延伸10min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，测序后回收PCR产物，与pMD18-T载体连接，转化感受态E.coli DH5a。提取质粒，酶切及测序鉴定后，用BamHI和Nde I双酶切重组质粒，回收目的基因片段，与经同样酶双酶切的pET-28a载体以T4连接酶连接，转化感受态细胞E.coli BL21(DE3)，挑取单菌落培养，抽取质粒，用BamH I和Nde I双酶切鉴定，测序正确的质粒命名为pET-28a-EGFP-Arg7。 2.2目的基因诱导表达与表达产物的纯化 将含有重组质粒pET-28a-EGFP-Arg7的E，coliBL21(DE3)菌株接种于含50uL／mL卡那霉素的LB培养基中，37℃培养12h后按2％接种量接种于二级瓶中于20℃摇床培养。当菌体密度A600达到0.4～0.6时，加入1mmol／L IPTG诱导培养12h，离心后收菌体，超声波破碎后分别取上清及沉淀，进行SDS分析。 取表达菌体裂解上清液进行Ni2+-NTA(Qiagen公司)亲和层析：将含有EGFP-Arg7的样品加入经Tris-C1缓冲液(10mmol／L Tris-C1，10％甘油，pH8，5)平衡的Ni2+-NTA介质中，用此缓冲液洗去未结合蛋白质，再用梯度浓度的咪唑溶液(20，200和500 mmol／L咪唑的Tris-C1缓冲液)依次洗脱，收集各洗脱峰，进行SDS分析。Ni2+-NTA亲和层析具