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实验二培养基的配制及灭菌 实验目的： 1. 掌握常用培养基的制备方法； 2. 了解培养基的成分、类型及特点； 3. 学会玻璃仪器的洗涤和灭菌前的准备工作。 4.了解培养基的配制原理和方法，掌握其配制过程和分装方法。 二、实验原理 人工配制的培养基是植物组织培养的营养基础，不同材料对培养基的要求不尽相同，适当地设计和选用培养基对组织培养是至关重要的，一个完整的培养基配方应包含有无机盐、有机营养、水、植物生长调节剂、琼脂及其他成分。培养基的主要成分的详细内容见课本p26~29。为了省时和减少多次称量的误差，一般先将药品配制成浓缩一定倍数的母液，用时稀释，储存于冰箱低温（2~4摄氏度）中待用。 基本培养基有8中母液，即大量元素母液、微量元素母液、有机物母液、钙盐母液、铁盐母液、肌醇母液、镁元母液、生长调节物质母液，基本培养基的配制方法有两种：一是可以将培养基的每种成分配成单一化合物的母液，便于配制不同种类的基本培养基时使用；二是配成几种不同的混合液，这样在大量配制同一种培养基时更省时、省力。在配制母液时应注意防止沉淀产生。绝大多数生长调节物质不溶于水，可以加热并不断搅拌促使溶解，必要时加入稀酸或稀碱等物质促溶。各类植物生长调节物质的用量极小,它们对外植体愈伤组织的诱导和根、芽等器官分化起着重要和明显的调节作用。通常使用的浓度单位是mg/L。 配制好的培养基应在24h之内完成灭菌工作，以免造成杂菌大量繁殖。灭菌方法有：高温高压灭菌、过滤除菌、射线除菌等方法。培养基常采取高压灭菌的方法，灭菌时间一般是在0.105MPa压力下，温度121摄氏度时，灭菌时间应根据容积的体积确定，所需最少时间见课本P32表2ˉ2。培养基必需保证绝对无菌，否则因其营养丰富细菌、真菌极易滋生而导致植物死亡。灭菌后的培养基不宜马上使用，以免造成培养材料的损失。 （一）、组成培养基的五类成分　　目前，大多数培养基的成分是由无机营养物、碳源、维生素、生长调节物质和有机附加物等五类物质组成的。1.无机营养物　　　3.维生素　　　　　　实验材料： 、培养液的配制　　大量元素(母液) ??????? mg／L NH4NO3????????????????????? KNO3??????????????????????? 19000? CaCl2·2H2O?????? 4400?? MgSO4·7H2O???????3700 KH2PO4????????????????????? 1700 2、微量元素(母液) KI?????????????????????? 83 H3BO3?????????????????????? 620 MnSO4·4H2O???????????2230 ZnSO4·7H2O????????????860 Na2MoO4·2H2O???????25 CuSO4·5H2O????????????2.5 CoCl2·6H2O?????????????2.5 3、铁盐(母液) FeSO4·7H2O????????????2780 Na2-EDTA·2H2O??????3730 4、有机成分(母液) 肌醇????????????????????? 烟酸?????????????????????? 盐酸吡哆醇(维生素B6)??????? 盐酸硫胺素(维生素B1)??????? 甘氨酸???????????????????? 注意： 以上各种营养成分的用量，除了母液为20倍浓缩液外，其余的均为200倍浓缩液。 上述几种母液都要单独配成1 L的贮备液。 母液、母液及母液的配制方法是： 每种母液中的几种成分称量完毕后，分别用少量的蒸馏水彻底溶解，然后再将它们混溶，最后定容到1 L。 母液的配制方法是： 将称好的FeSO4·7H2O和Na2-EDTA·2H2O分别放到450 mL蒸馏水中，边加热边不断搅拌使它们溶解，然后将两种溶液混合，并将pH调至5.5，最后定容到1 L，保存在棕色玻璃瓶中 各种母液配完后，分别用玻璃瓶贮存，并且贴上标签，注明母液号、配制倍数、日期等，保存在冰箱的冷藏室中。 MS培养基中还需要加入2，4-二氯苯氧乙酸、萘乙酸、6 苄基嘌呤等植物生长调节物质，并且分别配成母液(0.1 mg/mL)。 其配制方法是：分别称取这3种物质各10 mg，将2，4-D和NAA用少量(1 mL)无水乙醇预溶，将6BA用少量(1 mL)的物质的量浓度为0.1 mol/L的NaOH溶液溶解，溶解过程需要水浴加热，最后分别定容至100 mL，即得质量浓度为0.1 mg/mL的母液。 配制培养液用量筒或移液管从各种母液中分别取出所需的用量：母液为50 mL，母液、、A和B各5 mL。再取2，4-D 5 mL、NAA 1 mL，与各种母