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SOS/UMU实验对某地水体现状研究报告 一 研究背景： 由于水中化学物质种类繁多、组成复杂，准确地检测每个致癌物的浓度和毒性非常困难。为了控制水质的安全，根据DNA损伤诱导SOS反应而表达umu基因这一基本原理建立的SOS/Umu测试法，已经广泛应用于水质遗传毒性检测，能够快速、简便并能定量水质中多种致癌物质综合效应及其健康风险的评价方法。 基于致癌物质损伤DNA的原理，目前已开发了50多种短期遗传毒性测试方法。Ames检测法即沙门氏菌/微粒体检测法。由Ames等于1975年提出，是最早应用于饮用水水质检测的致突变测试方法，但该方法往往需要多种菌株，测试所用时间长（大约3d）,试验操作比较繁杂，要求严格的无菌操作，同时环境中的组氨酸会干扰检测，出现疑似阳性结果。另外，在Ames方法评价饮用水的致突变性时，往往采用定性描述。而SOS/Umu法由于实验周期短（一般为5-6h）’LacZ 嵌合体的质粒Psk1002，该质粒携带umu操纵子，umuD基因和umuC’LacZ融合基因的启动子及四环素和氯霉素耐药基因，允许通过药物选择转化株，新构建的细菌为Styhimurium TA1535/Psk 1002。当细菌受到诱导物作用引起SOS反应时，激活umuC’LacZ 融合基因，表达出有β-半乳糖甘酶活性的融合蛋白，通过检测此酶的活性可以确定受试物引起DNA损伤的程度。 水中可能存在着各类的遗传毒性物质，其中包括直接遗传毒性物质和需要经过代谢活化才能显示出遗传毒性的物质，即间接遗传毒性物质。间接遗传毒性物质一般不能在体外测试的SOS/Umu试验中直接得到充分体现，代谢活化体系—大鼠肝脏微粒体酶系统（S9）的引入，能较好地解决这一问题。 B:SOS/Umu实验操作具体步骤： 本试验选用鼠伤寒沙门氏菌TA1535/PSK1002菌株。该菌株具有umuC-LacZ的融合基因，可以通过测量β-半乳糖甘酶活性来评估样品的遗传毒性大小。 大鼠肝脏微粒体酶系统（S9）作为体外代谢活化，实验分别在加和不加S9两种情况（+S9,-S9）下进行。 用4-NQO（4-硝基喹啉）做不加S9的实验步骤如下： 隔夜培养： 实验前一天晚上接种菌株。从-80℃冰箱中取出菌株后，先往EP管中加入200ul LB（不含氨苄西林），然后3500r/min,离心3分钟，去除上清液，很明显看到EP管底沉淀下来的细菌，（此处目的是去除细菌冷冻保存时加入的冷冻保护剂DMSO），然后再向离心后的EP管中加入200ul LB（10mlLB中含氨苄西林储备液5ul，以后同此） ，与沉淀下来的细菌充分混匀后，转入10ml LB 培养基中，然后在30℃下震荡孵育培养16个小时。 前培养： 将前一晚培养的菌液，用TGA 培养基稀释50倍（取0.5ml菌液，加入到24.5mlTGA培养基中），然后放入恒温震荡箱中，30℃下培养2-4个小时，孵育至细菌密度在600nm（紫外光）处的测量值为0.25-0.3之间，然后进行下一步的实验。（使用酶标仪进行测量，TGA为空白对照，用A600菌液与A600TGA，相减后所得的值在0.25-0.3之间即可）。所用TGA每100ml含50ul氨苄西林。 化学物质暴露： 暴露实验中 取612ul水，108ul4-NQO，80ul10×TGA，280ul菌液，混匀，作为阳性对照。 取612ul水，108ulDMSO/水（3:7），80ul10×TGA，280ul菌液，混匀，作为溶剂对照。 取720ul水，80ul10×TGA，280ul菌液，混匀，作为阴性对照。 取720ul水，80ul10×TGA，280ulTGA，混匀，作为空白对照。 以上试剂中，水是纯水，4-NQO（贮液为1g/L） 溶于DMSO/水（3:7）中,做2000倍稀释。 37℃水浴振荡2小时。 用温热的TGA将1）中培养的物质稀释10倍。 从1）中反应管中各取100ul混合物分别加入到1.5ml EP 管中，其中已含有900ul 的TGA 。然后再在37℃的恒温水浴箱中培养2小时。 从2）中各取200ul 加入到96孔酶标板上，然后用酶标仪其在600nm处的吸光度值，记录下测量结果。 同时从2）培养后混合物中各取120ul,加入到已装有480ul Z-Buffer缓冲溶液的EP管中，再各加入120ul显色剂ONPG的磷酸盐缓冲溶液；然后在28℃下的恒温水浴箱中震荡培养30min, 后加入480ul 1mol /L的Na2CO3溶液终止反应。 然后取4）培养后的混合物各200ul 到96孔酶标板上，测其在420nm处的吸光度值。 试验中4-NQO的反应时的浓度为5×10-5 g/L。实验步骤是参照 ISO 13829国际标准来做。 ④计算：代入以下公式 生长因子 G =（A600样—A600