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PCR原理及其应用 姓名：曹宇 学号：20104032303 班级：动物医学(3)班 摘要：聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)是体外扩增DNA序列的技术。它 与分子克隆和DNA序列分析方法几乎构成了整个现代分子生物学的实验工作的基础。在这 三种实验技术中，PCR方法理论上出现最早，实践中应用也最广泛。PCR技术使微量的核 酸(DNA或RNA)操作变得简单易行，同时还可使核酸研究脱离于活体生物。PCR技术 的发明是分子生物学的一项革命，极大地推动了分子生物学以及生物技术产业的发展。 关键词：聚合酶链式反应 一 PCR发展简史 核酸研究已有100多年的历史。20世纪60年代末70年代初人们致力于研究基因的体 外分离技术，但由于核酸的含量较少，在一定程度上限制了DNA的体外操作。Khorana于 1971年最早提出核酸体外扩增的设想：“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚 合酶延伸引物，并不断重复该过程便可合成tRNA基因”。但由于当时基因序列分析方法尚 未成熟，热稳定的DNA聚合酶尚未报道，以及寡聚核苷酸引物合成还处在手工及半自动合 成阶段，这种想法似乎没有实际意义。 1983年的一天，美国科学家Kary Mullis驱车在蜿蜒的州际高速公路上行驶中，孕育出 了PCR技术的原型。经过两年的努力，他在实验上证实了PCR的构想，并于1985年申请 了有关PCR的第一个专利，在Science杂志上发表了第一篇PCR的学术论文。从此PCR技 术得到了生命科学界的普遍认同，Kary Mullis也因此获得了1993年的诺贝尔化学奖。但 Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段，这虽然较传统 的基因扩增具备许多突出的优点，但由于Klenow酶不耐热，在DNA模板进行热变性时， 会导致此酶钝化，每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期，给PCR技术操作程序添了不 少困难。这使得PCR技术在当时成了一种笨拙的中看不中用的实验室方法。 1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR，其扩增的DNA片段很均一，真 实性也较高，只有所期望的一种DNA片段。但每循环一次，仍需加入新酶。 1988年Saiki等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(Thermus aquaticus)中提取到一种 耐热DNA聚合酶。此酶耐高温，在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶， 从而极大地提高了PCR扩增的效率。为与大肠杆菌聚合酶I Klenow片段区别，将此酶命 名为Taq DNA聚合酶(Taq DNA polymerase)。此酶的发现使PCR方法得到了广泛的应 用，也使PCR成为遗传与分子分析的根本性基石。 在以后的十多年里，PCR方法不断地被改进。例如，应用具有3’一5’修复活性的热稳 定DNA聚合酶代替不具3 7—5 7修复活性的Taq DNA聚合酶，减少了在扩增过程中产生的 错误配对，大大提高了在复制过程中的真实性。原来的PCR只能扩增两段已知序列之间的 DNA，现在可以扩增到已知序列两侧的未知序列[11，甚至可以扩增到序列未知的新基因[2l。 PCR的樟梅托从原桌兽用的DNA发展到直接用RNA作为模板，即反转录PCR，这就使得无目的基因存在，现在已经可以用来定量测定[3]，即回答样品中原始模板的确切数目。 PCR扩增的片段也从原先只能扩增几个kb的基因到目前已能扩增长达几十个kb的DNA片 段[4|。PCR也从单纯用来扩增基因到能将两个以上的基因连接起来，省去了限制性内切酶 消化和用连接酶连接的步骤，这就是所谓的克隆PCRE5]。再加上PCR方法与其他方法联合 应用，到目前为止已报道的PCR方法有几十种之多。 总之，自PCR方法建立以来，在20多年的时间里发展很快，已有一系列PCR方法被 设计出来，并广泛应用于遗传学、微生物学乃至整个生命科学研究中。PCR的建立大大地 推动了生命科学的发展。由于PCR的实用性和极强的生命力，PCR方法还将会被不断完 善，进一步在生命科学研究中发挥更大的作用。 二PCR技术的基本原理和操作 PCR的基本原理 PCR的基本工作原理是以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板互补的寡核苷 酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成 新的DNA合成。不断重复这一过程，可使目的DNA片段得到扩增。因为新合成的DNA 也可以作为模板，因而PCR可使DNA的合成量呈指数增长(图1—1)。 PCR的基本成