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PCR技术对牛早期胚胎性别鉴定的研究 09动物科学 XXX YYYYYY 【摘 要】 PCR技术是20 世纪80 年代中期发展起来的一种在生物体细胞外通过酶促合成特异DNA 或DNA 片段的方法，具有高效、灵敏，特异性强等特点，在生物科学各个领域中均发挥了巨大的作用。PC R 技术能十分有效地鉴定出移植前牛胚胎的性别, 而且能适用于生产实践。可以帮助养殖者充分有效的利用资源, 获得更高的经济效益。本文对PCR( 聚合酶链式反应) 的基本原理、优点、方法及其在牛胚胎性别鉴定中的应用情况进行了扼要综述。 【关键词】 胚胎,性别鉴定,PC R ,牛 自从19 世纪70 年代中期胚胎移植( ET) 技术在商业领域中得到广泛应用以来, 提前判别胚胎的性别一直是研究人员及养殖者热望的问题。PCR (Polymerase Chain Reaction)技术即聚合酶链式反应技术, 因其具有快速、敏感、简便及特异性强等特点, 很快被用于传染病诊断、法医鉴定、基因工程等领域。自从Herr 等( 1990) 报道了用PCR 进行奶牛胚胎性别鉴定之后, 利用PCR 技术鉴别家畜胚胎性别更是引人注目。现将PCR 的发展及其在牛胚胎性别鉴定上的应用作一综述。 1.PCR技术 PCR是聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction)的缩写，是一种在生物体细胞外通过酶促合成特异DNA或DNA片段的方法，又称多聚酶链反应、无细胞克隆技术等。PCR技术主要由高温变性、低温退火和适温延伸3个步骤反复的循环构成，是在一种特异耐热酶－Taq DNA聚合酶的催化下完成的由DNA聚合酶催化反应。其基本原理是用寡聚核苷酸引物结合在模板DNA (或靶DNA)分子上进行特异核苷酸序列扩增。按理论计算，一般DNA短链经过20次PCR循环将产生约100万倍的扩增产物，被广泛应用农业、食品工业、医学及 分子生物学等各个领域。 2. PCR法鉴别动物早期胚胎性别的机理 2.1. 性别决定的发育学机制 动物胚胎发育的早期阶段为性别未分化期，仅有位于中肾内缘的性腺原基，这种未分化的性腺中胚层处于中性。动物性别决定的取向是未来性腺发育的导向，而性别决定的结果义是通过性腺分化及性表型来体现的。胚胎生殖腺的发育类型是性别形成的决定物质。 2.2.性别决定的分子生物学机制 哺乳动物性别发育大致可分为性别决定和性别分化两步，是一个由性别决定基因(sex determining region of Y，SRY)、缪氏体抑制物基因(miilerian inhibiting sub—stance，MIS)等多基因参与的级联过程，目前对于这些基因之间的相互作用尚不清楚(张艳萍等，2006)。但研究结果表明，SRY／Sry不但与睾丸决定有关，而且还是睾丸决定过程中所需的唯一来自Y染色体的基因。有人把Y染色体上的pY53．3(2．1 kb)区段称为SRY，并认为SRY就是睾丸决定因子(testis determining factor，TDF)。因此，SRy基因是Y染色体的性别决定序列，是主宰性别的睾丸决定因子的遗传基础，它的作用贯穿于性腺发育的全过程。而且SRy基因有自启动转录功能，在胚胎睾丸组织细胞系表达产生SRYl因子，激活下游的儿4 bp启动子，进而使下游的MIS表达，导致抗苗勒激素(antimul|erian hormone，AMH)分泌，抑制缪氏管发育，同时SRYl因子作用于间质细胞，促使其发育分泌睾胴产生雄性结构(王学峰等，2001){1}，并且人们已经证实了哺乳动物的性别是由性染色体所决定的，受环境影响较小。 2.3. PCR法鉴别动物胚胎性别的机理 由于SRY是雄性高度特异性因子，是判断性别最可靠的依据，为胚胎性别鉴定提供了准确无误的技术途径，与PCR扩增技术相结合，可以应用于早期胚胎性别鉴定。由于SRY基因在哺乳动物中高度保守，因此用PCR法进行性别鉴定时可以用相同的引物鉴定不同动物。PCR扩增法是一种模仿体内DNA复制的过程，主要是针对SRY基因的DNA序列设计特异引物，并通过PCR扩增胚胎SRY特异DNA序列，扩增产物经某种方法检测分析目的片段的大小来鉴别胚胎的性别。 3. PCR法鉴别牛早期胚胎性别技术 3.1.早期胚胎的取样 胚胎样品的取样是决定胚胎性别鉴定能否成功的关键步骤之一。胚胎样品的好坏主要受发育时期、取样细胞个数和取样方法等因素的影响。由于胚胎细胞取样技术的限制，对胚胎造成一定的损伤，导致移植受胎率较低。到目前为止，中国鲜胚取样后的移植受胎率平均在25％左右，冻胚取样后的移植受胎率的实验室数据为21％--25％(张锁链等，2002){2}。胚胎发育时期对移植妊娠率影响不大，但64细胞之前致密桑葚胚、致密晚桑葚胚和早期