PCR及其衍生技术在病原微生物检测中的应用研究.docVIP

PCR及其衍生技术在病原微生物检测中的应用研究 摘要：,随着现代生物技术的快速发展,建立在分子生物学基础上的快速检测病原微生物技术得到了迅速的发展。由于PCR技术具有敏感、专一等特点,不仅可以对病原微生物进行特异性识别,而且可以鉴别同一种类病原微生物的致病性菌株和非致病性菌株,因此应用PCR技术进行病原微生物的检测具有十分独特的优势。文章介绍了PCR及其衍生技术RT-PCR、实时荧光定量PCR、免疫-PCR、多重PCR、套式引物PCR、巢式PCRPCR检测技术的原理 聚合酶链式反应()，又称为无细胞克隆技术()，是一种根据生物体内NA复制的某些特点而设计的，在体外对特定DNA序列进行快速扩增的技术。自美国Cetus公司人类遗传室Kary Mullis及其同事于1985年发明聚合酶链式反应(PCR)以来，PCR技术及其相关技术就以惊人的速度发展起来，在多种核酸检测技术中都得到了广泛的运用。PR反应体系主要由寡核昔酸(引物)、4种dNTP、TqDNA聚合酶、靶序列DNA和PR反应缓冲液体系组成，它改变了传统分子克隆技术的模式，不通过活细胞，而是将扩增建立在三步重复发生反应的基础上①通过热处理将双股DNA变性裂解成单股DNA②退火延伸引物至特异性寡核昔酸上③酶促延仲引物与DNA配对合成模板，引物退火，变性DNA片段，引物杂交形成的模板可参与再次反应。溶液中核昔酸通过聚合酶的作用形成互补的DNA片段，并能重新裂解成单股DNA，成为下次PR复制的模板。因而每次循环特异性DNA片断将以双倍量增加，典型扩增经过20~4次循环能引起100万倍的扩增，大大提高了DNA的得率。因此，当知道待检病原具有某一特定基因片段时，即可利用特异性的引物对样品中微量的目标DNA进行PCR扩增，增加靶DNA数量，使其达到足够的检测量，通过电泳检测扩增出的特定片断，即可确定感染的病原。 2.1、普通PCR的应用 普通PCR的原理就是根据病毒或其他病原体的已知保守核昔酸序列设计出引物，对待测核免疫PCR技术是1992年，Sano T.等建立的检测微量抗原的高灵敏度技术。该技术将血清学中抗原抗体反应，与聚合酶链反应特异扩增一段DNA分子的技术结合起来，用一段具体的DNA分子标记抗体，应用此抗体去检测抗原，PCR扩增此段DNA分子，电泳定性，根据此段DNA分子是否存在，来显示抗原是否存在。其一般程序如下：在酶联板内包被捕获抗原的抗体，加入待检测抗体，温育后充分洗涤，PCR扩增粘附在抗体/抗原复合物上的DNA分子，电泳显示结果。 在病毒感染的检测方面,有许多研究人员利用免疫PCR技术对病毒感染进行了检测Kakizald[11]等报道T在感染的是脚鱼(serioladumem劝中运用免疫PCR检测病原巴斯德氏菌，结果表明利用它可检测出34c的病原菌，而对照使用的ELISA方法只能检测出3.4xl04c的菌。McKie等对血清中腮腺炎病毒的特异性抗体进行了检测。在细菌检测方面巢式PCR巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应，使用两对（而非一对）PCR引物扩增完整的片段。第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似。第二对引物称为巢式引物（因为他们在第一次PCR扩增片段的内部）结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。巢式PCR的好处在于，如果第一次扩增产生了错误片断，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。因此，巢式PCR的扩增非常特异。 Lin C S,Lu M W,Tang L,et al.Charaeterization of viruslike partieles assembled in a recombinant baculovirus system ex2pressing the capsid protein of a fish nodavirus [J].Virology，2001，290(l):50-58. Sano T,Smith CL,Cantor CR.Science,1992;258(5079):120-122 [11]Kakizald E，Miyoshi SI.Detection of baeterial antigens using immuno-PCR[J」.Lett Appl Micmbiol，1996，23(2):101-103. [12]McKie A, Samuel D, Cohen B, et al. Development of a quantitative immuno-PCR assay and its use to detect mumps-specific IgG in serum. J Immunol Methods, 2002, 261(1-2): 16