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PCR扩增产物的分析方法 微孔板夹心杂交法 颜色互补分析法 PCR-ELISA法 PCR-OLA法 PCR-打点杂交法 ?微孔板夹心杂交法： 　　该法是通过一固定于微孔板的捕获探针与PCR产物的某一区域特 异杂交使产物的间接地固定于微孔板上，然后，再用一生物素 等非放射性标记物标记的检测探针与产物的另一特异性较一次 杂交，漂洗后显色即可判断结果。该法需要两个杂交过程来检测 一个产物，因此，其特异性较一次杂交的检测法高。该法已用于HBV 的检测，其敏感度可达5个HBVDNA分子。此法的敏感性和特异性与 PCR32P探针的Southern杂交法相当。但PCR微孔板夹心杂交法操作简 便、快速、避免了同位素标记探针的危害，显色反应类似于临床常 规应用的ELISA，适于临床实验室常规应用。另一种微孔板杂交法不 是采用夹心法，而是直接将特异探针固定微孔板上，然后用生物素 标记的PCR产物杂交。微孔板杂交与膜印迹杂交相比，有如下优点： 前者易操作；固相微孔板漂洗时间短，节省了检测时间，因为 膜杂交过程中，反应剂要浸透膜中，漂洗时，使反应剂全部浸出需 要时间较长；本底低，微孔板杂交不需Dehatdt液和预杂交以及封 闭过程。另外，微孔板固定的DNA不需再加热或UV照射。 　　微孔板杂交的基本过程包括L：DNA的固定，探针的杂交和酶联显色。 DNA的固定 　　在一定盐浓度条件下，DNA单链的一端可固定在微孔板上。不同来源 的微孔板固定DNA时所需盐浓度不同。因此，必须用一系列的盐浓度 （0.15mol/L至3.0mol/LNaCl）来固定加热变性的核酸，然后，用固 定浓度的标记探针杂交。显色后，判断合适的固定盐浓度。固定方 法的选择必须使DNA最大量的固定，且不影响杂交。用合适浓度的 NaCl或(NH4)2SO4可达到此目的。硫氰酸钠则无固定作用。盐浓度合 适时，DNA应为一端固定到微孔板上，而太低或太高浓度的盐可能使 DNA“平躺”固定在孔内而影响杂交。Mg2+虽有促进DNA固定的作 用，但它可激活Dnase，所以，一般不用。被固定的DNA应大于300bp， 否则影响杂交结果。每孔可固定高达200ng(624bp)的DNA。合适的盐 浓和固定量一经确定，可按下法固定DNA。 　　待固定DNA100加热5min变性并立即冷却。 　　与合适的固定液混合后，加入微孔板的孔内。固定液：10mmol/L磷 酸钠-10mmol/LEDTA，pH7.0，合适浓度的NaCl（与DNA变性混合后， 终浓度为最适固定浓度）。 　　用胶布封好，浸于37水浴2h。 　　用PBS-0.05%Tween20漂洗3次。 　　立即用于杂交，或封闭于塑料袋内保存。 杂交 　　可采用标准的杂交系统杂交。夹心杂交时，是将变性的PCR产物与检 测探针一并加。杂交与漂洗时间均较一般膜杂交短。 显色 　　根据不同酶标检测分子的不同选择不同的底物、终止剂和测定波 长。 颜色互补分析法(A) 　　颜色互补分析法是利用三原色原理，当不同DNA片段（A和B）同时扩增时，用引 物5’端修饰技术将不同引物用不同颜色荧光素标记（A片段引物标记绿色的荧 光素，B标记红色的罗丹明）。如果仅有一条片段被扩增，扩增产物激发后，只有 一种颜色（红色或绿色）。如果两条不同大小的片段均被扩增，可通过电泳分离，紫 外激发后可观察到不同颜色的两条带。如果两条被扩增片段大小相同，电泳后可见一 条红绿互补色-黄色带。如果不用电泳法分离扩增片段，通过一定手段除未掺入引 物，亦可观察到扩增产物的颜色。此时，扩增产物无论大小，只要均被扩增，就可见 一条红绿互补的黄色条带。 　　该法简便、易于自动化，可用于检测基因，缺失、染色体转位和病原微生物。这种情 况下，只需判断产物的有无。另外，在检测多种基因实变、多种病原菌和HLA分型 时，可用复合PCR。此时，不同引物可用不同荧光素标记（如绿色的ROX；蓝色的COUM 等）。 PCR-ELISA法：(A) 　　本法避免了电泳和杂交的步骤，适于常规ELISA记数仪检测。因为5’端修饰后仍 可进行常规PCR扩增特异靶序列，因此，可以通过修饰其中一个引物的5’端使其携带 便于PCR产物固定的功能基团，而通过另一引物5’端的修饰使产物便于检测。 　　链霉亲和素的包被：不同厂家的聚丙乙烯微孔板的包被效果差异并不显著。亲和层析纯化的链霉亲和素（13U/mg，Sigma公司）用PBS-Tween液140mmol/LNaCl， 2.7mmol/LKCl，4.3mmol/LNa2HPO4，1.4mmol/LK2HPO4，0.05%(w/v)Tween20，Ph7.2 配成1μg/ml。向微孔板的每孔内加入100μl，封好，室温过夜。 用PBS液漂洗。 　　扩增产物与包被板的结合：PCR产物1