宿主vero细胞DNA残留量SOP.docVIP

宿主vero细胞DNA残留量操作规程 试剂 （1）DNA标记和检测试剂盒 （2）TaKaRa universal Genomic DNA Extraction Kit ver3.0（DV811A） (3 ) TaKaRa DNA Fragment Purification Kit(807A) （4）DNA杂交膜: 尼龙膜 （5）2%蛋白酶K溶液：称取蛋白酶K0.20g，溶于灭菌水10ml中，分装后储存于-20℃备用。 (6) 3%牛血清白蛋白溶液 ：称取牛血清白蛋白0.30g,溶于灭菌水10ml中。 (7) 1mol/l三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶液（Ph8.0）:用盐酸调pH至8.0。 (8) 5.0mol/l氯化钠溶液 （9）0.5mol/l乙二胺四乙酸二钠溶液（pH8.0）用10mol/l氢氧化钠溶液调节至8.0。 （10）20%十二烷基硫酸钠(SDS)溶液：用盐酸调pH至7.2。 （11）蛋白酶缓冲液（pH8.0）量取1mol/l Tris溶液1.0ml（pH8.0），5mol/l氯化钠溶液2.0ml，0.5mol/l乙二胺四乙酸二钠溶液（pH8.0）2.0ml，20%SDS溶液2.5ml，加灭菌水至10ml。 （12）TE缓冲液（Ph8.0）量取1mol/l Tris溶液10ml，0.5mol/l乙二胺四乙酸二钠溶液（pH8.0）2ml，加灭菌水至1000ml。 （13）1%鱼精DNA溶液：精密称取鱼精DNA0.10g,置10ml量瓶中，用TE缓冲液溶解并稀释至刻度，摇匀，用7号针头反复抽打以剪切DNA成为小分子，分装后贮藏于-20℃备用。 （14）DNA稀释液：取1%鱼精DNA溶液50μl，加TE缓冲液至10ml。 （15）washing buffer：0.1M 马来酸；0.15M氯化钠；0.3%Tween 20; PH7.5。 （16）马来酸溶液：0.1M 马来酸；0.15M氯化钠；PH7.5。 （17）检测液：0.1M Tris-Hcl；0.15M氯化钠；PH9.5。 一、用于标记探针和阳性对照的DNA制备 1.DNA的提取：用TaKaRa universal Genomic DNA Extraction Kit ver3.0（DV811A）试剂盒提取DNA。 2.测定DNA的吸光度：用TE将DNA稀释适当倍数，使DNA的A260值在为0.2-1.0之间（一般为40倍），然后在紫外分光光度计测定其波长在260nm和280nm的OD值，并且A260/ A280应在1.8-2.0之间。其含量（μg/ml）为：A260×50×稀释倍数。 3.酶切DNA：取DNA约1μg，用HaeⅢ酶（TaKaRa D1051A）酶切1小时，用1%琼脂糖凝胶电泳检测其片段大小是否被切开。 4.酶切反应液中DNA的回收:使用TaKaRa DNA Fragment Purification Kit(807A)回收酶切反应液中的DNA, 然后在紫外分光光度计测定其波长在260nm和280nm的OD值，并且A260/ A280应在1.8-2.0之间。其含量（μg/ml）为：A260×50×稀释倍数。 5.将上述4中回收的DNA作为阳性对照品，标明DNA浓度,分装于EP管中，-20℃以下保存。 二、探针的制备 1.取标准DNA约1μg加灭菌水至终体积16μl。 2.变性：沸水浴煮10min，立即冷却2min。 3.取Via1 4μl加到变性的DNA中，混合均匀，放入37℃温箱中放置过夜。 4.次日，取出3，向其中加入2.0μl 0.2M EDTA(PH8.0)，2.5μl 3M(PH5.2) NaAc，冰无水乙醇75μl，-20℃放置2小时。 5.取出4，4℃ 12500rpm 离心15min，轻轻倒掉上清。 6.加入70%乙醇约150μl，缓慢晃动，4℃ 12500rpm 离心15min，弃掉上清。 7.室温晾干。 8. 加入50μl TE(PH8.0)，吹打管底，放于-20℃保存，作为探针。 三、探针效力的检测Vial 2标准品，用稀释液将其稀释为10pg/ul、3 pg/ul、1 pg/ul、0.3 pg/ul、0.1 pg/ul、0.03 pg/ul、0.01 pg/ulul 点至尼龙膜上。 3.固定：将点样后的膜，放置干燥箱中，80℃ 2h 。 4.封底：在10ml中blocking solution(用马来酸溶液将Vial 6做10倍稀释，即blocking solution)中孵育30min。 5.加入酶结合物：在antibody solution(用blocking solution将Vial 4做5000倍稀释即antibody solution)中孵育30min。 6.洗膜：用10ml wash buffer洗2 遍，