寒假实验总结.docxVIP

实验阶段总结学生：傅雪金内容：一、对所提取的阳性重组质粒进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳验证。二、提取足量的质粒三、重组质粒转化表达宿主（BL21；此过程包括抗性平板筛选）四、基因在E.coli中的少量诱导表达五、目的蛋白的可溶性分析六、基因在E.coli中的大量诱导表达七、试观察不同温度及不同菌液接种后蛋白表达量八、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）九、可溶性表达产物（蛋白）的Ni-NTAagarose亲和层析纯化一、对所提取的阳性重组质粒进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳验证。1、双酶切系统：10xHbuffer 2ul0.1%BSA 2ulECOR I 1ulNOT I 1ul28-SAMS 14ulTotal 20ul条件：2.5小时 37℃水浴加热电泳上样量：10ul样品+2ul 6xloading buffer 5ulMark+2ul 6xloading buffer上样顺序：1 大Mark λ-HindⅢ，2 未酶切质粒，3 双酶切后质粒，4小Mark Dl2000，5小Mark Dl2000结果如图（2011.12.19酶切质粒）： 1 2 3 4 5由图分析：未酶切完全，可能是因为构建的酶切系统不佳或酶切时间不足。2、将电泳后剩余的酶切后的体系置于37℃水浴锅中继续酶切过夜 上样顺序：1 大Mark λ-HindⅢ，2 未酶切质粒，3 双酶切后质粒，4小Mark Dl2000，5小Mark Dl2000结果如图（2011.12.20补图酶切质粒过夜）：1 2 3 4分析：酶切效果仍不佳，可能是酶切所设计的系统不好二、提取足量的质粒利用前面甘油保种的阳性转化菌，接种过夜培养，第二天提取质粒。此次提取质粒的验证：上样顺序：1λ-HindⅢ，2质粒①，3质粒②，4质粒③，5质粒④（2011.12.21质粒提取结果图） 1 2 3 4 5结果分析：质粒提取成功双酶切验证：使用了质粒②和④用于酶切上样顺序：1 大Mark λ-HindⅢ,2未酶切质粒④，3未酶切质粒②4酶切质粒④，5酶切质粒②，6小Mark Dl20007酶切质粒④，8酶切质粒②结果图（2011.12.22酶切结果图A和B2）： 1 2 3 4 5 6 7 8三、重组质粒转化表达宿主（BL21；此过程包括抗性平板筛选）1.从-70℃冰箱中取出一支含200ul的感受态细胞，置于冰浴中溶解15min。2.加入2-3ul标准质粒，冰浴30min，期间每隔5-10min轻柔上下颠倒几次。3．将离心管放置42℃水浴锅中热击90s(不可移动离心管)，立即置于冰浴中90s。4、往离心管中加入800 μL LB培养基，混匀后将培养基移至无菌试管，在37℃条件下振荡培养1 h，使细菌复苏、质粒携带的抗生素抗性得以表达。5、吸取200 μL菌液涂布于LB卡那霉素抗性平板上。6、将剩余的800 μL菌液于10000 r/min离心30s，弃去600 μL上清，将剩余浓菌液200 μL涂布于LB卡那霉素抗性平板上。7、待晒干后，平板倒置，37℃培养16～24 h，观察菌落生长情况。未能涂布一个感受态细胞作为阴性对照。注：此步一次性已成功，浓板长的菌落密集且较小，稀平板的菌落稀疏分布教均匀。故选用稀平板挑菌。四、基因在E.coli中的少量诱导表达从LB平板（含抗生素：卡那霉素）挑取单菌落接种至10mLLB培养基（含抗生素：卡那霉素），可适当多接几个单菌落培养瓶，置于37℃摇动（200rpm）培养过夜。按过夜培养物：30%甘油=1：1的比例（各500ul）保种于1.5ml的离心管中。剩余过夜培养物按1：100转接于10mLLB培养基（含抗生素：卡那霉素）即向培养基中接入100ul过夜菌液，如此转接3瓶，分别编号为①②③，37℃继续振摇培养。①号瓶培养至细菌生长对数中期（OD600值达0.5-0.6,大概需要培养时间为2.5h），加入浓度为0.5mol/l的异丙基-D-硫代半乳糖苷（IPTG）10ul，在37度摇床条件下诱导表达约6h。②号瓶培养至细菌生长对数中期（OD600值达1.5，大概需要培养时间为3h），加入40mg的乳糖粉末即使其最终浓度达到4mg/ml，在37度摇床条件下诱导表达约6h。③号瓶在37度摇床下继续培养6h。五、目的蛋白的可溶性分析诱导表达后的菌液按3ml每管12000rpm离心5min收集菌体，尽量去除培养基。沉淀的细胞加入500ul预冷的破菌缓冲液，借助移液枪将所有细胞沉淀悬浮。取上述悬浮菌液，冰浴条件下进行超声波破菌，至菌液为透明澄清状，一般破菌次数为10至15次。从上述的透明液中取出