第三章 核酸扩增技术课件.pptVIP

第三章 核酸扩增技术 Polymerase Chain Reaction　techniques 大纲要求： 掌握PCR的原理和反应过程 掌握PCR反应体系 掌握PCR产物的检测 熟悉实时荧光定量PCR的原理和方法 了解以PCR为基础的相关技术 二、教学内容 第一节 聚合酶链式反应 第二节 以PCR为基础的相关技术 第三节 PCR产物的检测 第X节 实时荧光定量PCR 基础知识 遗传中心法则 DNA变性(denaturation) 定义：在某些理化因素作用下，DNA分子内碱基对之间的氢键断裂，使规则有序的双螺旋结构变为不规则无序的单链线团样结构的过程。 基础知识 　　　　　DNA复性 定义：变性的单链核酸分子在一定条件下按碱基互补原则重新结合为双链核酸的过程，称复性或杂交。 热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，此过程称为退火(annealing)。 dNTP dATP dCTP dGTP dTTP 第一节 聚合酶链式反应 PCR概念：在体外特异地复制一段已知序列的DNA片段的过程。 一、PCR的原理和反应过程 PCR反应重复进行DNA复制的过程，使DNA得以扩增，每一次复制包括3个步骤： 变性（denaturation） 退火（annealing） 延伸（extension） 变性（denaturation） 将待复制的双链 DNA经加热至94℃～95 ℃）左右一定时间后，DNA双螺旋的氢键断裂，使之成为单链分子，作为反应的模板（template) ，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； 退火（annealing） 温度降低至寡核苷酸（oligonucleotide）引物的融点温度以下（40～70℃），使引物能与模板互补结合，形成杂交链； 延伸（extension） 将温度升至72℃左右，使反应体系中的DNA聚合酶按照模板链的序列以互补的方式依次把dNTP加至引物的3’端，使杂交双链不断延伸，以至形成新的DNA 双链。 模板(template) 模板就是将要被复制的核酸片段，包括基因组DNA、RNA、质粒DNA和线粒体DNA等。 在用 RNA作为模板时，须先将 RNA逆转录为cDNA，再以cDNA作为PCR反应的模板进行扩增反应。 耐热DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶（Taq DNA polymerase）是从一种生活在热泉（80～90℃）中的水栖噬热菌（Thermus aquaticus）中提取的，有很高的耐热稳定性。TaqDNA聚合酶的作用是催化DNA合成，即在模板指导下，以dNTP为原料，在引物的3’-OH端,加上dNTP,在二者间生成3’ ，5’-磷酸二酯键，使DNA链沿5’→3’方向延伸。 dNTPs 即dATP、dCTP、dGTP和dTTP四种脱氧核苷三磷酸的混合物。 反应体系中4种核苷酸的浓度必须一致 四种核苷酸间浓度的不平衡会增加反应时DNA聚合酶错配的机率。 浓度过高会加快反应速度，但导致非特异性扩增 降低在dNTP浓度会提高反应的特异性 一般为20~200umol/L 镁离子浓度 镁离子浓度在扩增反应中是一个至关重要的因素，因为镁离子对于反应系统本身、稳定核苷酸和提高Taq DNA聚合酶的活性有直接的影响。 Mg2+浓度过低使酶活力降低 Mg2+浓度过高又会使酶催化非特异性扩增。 一般为1.5mmol/L 引物(Primer) 引物是化学合成的已知序列的寡核苷酸(oligonucleotide)分子。 引物决定PCR扩增产物的特异性和长度。 引物设计时必须遵循的原则（6条） 用于PCR反应的引物需要二条，分别设在被扩增目标片段的二端，并分别与模板正负链序列互补。 引物的长度一般以18～25个核苷酸为宜 引物过长容易产生寡核苷酸的链内互补，形成发夹状结构， 引物过短则会降低扩增的特异性； 引物设计时必须遵循的原则 二条引物之间（尤其在3’端）的序列不可有互补，以免形成引物二聚体； 引物的碱基组成应平衡，避免出现嘌呤、嘧啶碱基堆积。 C＋G的比例一般为45~55%。 引物设计时必须遵循的原则 PCR扩增中的退火温度是根据引物的Tm值而决定的，二条引物的Tm值不能差别太大。 根据需要，合成引物时在其5’端可以加修饰成分 如加入酶切位点，用生物素、荧光素、地高辛等标记，引入突变位点，引入启动子序列，引入蛋白质结合DNA序列等。 三、 反应条件 1、温度 ①变性温度：一般把变性温度定在95～97℃之间，以使模板DNA和产物双链完全打开。 ②退火温度：退火温度决定PCR反应的特异性，退火温度的设定取决于引物的Tm，通常PCR的退火温度应低于引物Tm　5℃左右。 ③延伸温度：一般为72℃，在这个温度下Ta