第八章色谱分离技术1-2节.pptVIP

第八章 色谱分离技术 河南科技大学林业职业学院生物技术教研室刘耀玺 认识到这种层析现象在分离与分析方面重大价值的是俄国植物学家茨维特。 茨维特一生从事植物色素的提取与分离工作。他关于色谱分离的方法研究始于1901年，在1903年3月21日华沙自然科学学会生物学会会议上，作了题为“一种新吸附现象及其在生化分析上的应用”一文，提出了应用吸附原理分离植物色素的新方法。即以碳酸钙粉作吸附柱来分离树叶中的色素提取物，并用石油醚来冲洗吸附柱，树叶中的色素便分离成许多不同的色层，排列在柱上，随着冲洗逐渐向下移动，这些黄、绿的色层就更加清晰，称这种方法叫色层分析法。 称色谱法是由两个希腊字Chroma(色彩)+Graphas(图谱)所组成。 所得到色柱称为色(层)谱(Chromatography)。 在1907年德国生物学学会会议上，茨维特第一次向人们展示采用色谱法提纯的植物色素溶液以及色谱图——即显示着彩色环带的柱管。但是当时的茨维特还不是一位著名的植物学家，而他的色谱论文又仅仅以俄文发表，刚刚诞生的色谱分离技术并没有引起足够的重视。直到过了近三十年才逐渐被重新认识为一种好的分离手段，得到较多应用。 Kahn与Lederer为证实蛋黄内叶黄素系植物叶黄素与玉米黄质的混合物，参考茨维特的文章，采用了色谱法，他们用碳酸钙装填色谱柱，成功地从蛋黄中分离出植物的叶黄素。Kahn、lederer工作的重要意义不仅仅在于证明了蛋黄叶黄素是氧化类胡萝卜素的混合物，更重要的是证实了茨维特的方法可以用来进行制备分离，并广泛应用于各种天然有机物的分析与分离。 1941年A.J.P.Martin和R.L.M.Synge为解决氨基酸的分析问题，将溶剂抽提中的一个相固定在硅胶上，装在柱内，并按色谱法操作，使另一相流过柱子，获得了分离成功，从此出现了基于分配原理的分配色谱法。他们二人因此获得了诺贝尔奖金。 以后的发展采用了纸纤维，继而采用滤纸 作为分配色谱法的载体，R.Consden、 A.H.Gorden和A.J.p.Martin于1944年发表了第一篇纸色谱的论文，不久就得到广泛应用，在微量分析和分离、医药生化及其它许多方面的研究中发挥了很大的作用。 近四十年来，层析法获得了迅速发展，尤其是与各种物理化学方法结合起来，创造了各种新的分析技术，广泛应用于生产和科研实践中。 在天然产物化学成分研究利用方面，它不仅用于分离混合物，也可以用于鉴定某些化学物质的纯度、定性、定量分析。尤其对植物样品中一些结构相似的成分，用一般的重结晶、萃取等方法不易得到分离的，采用层析法往往能得到满意的结果。 另外，色谱分离已经成为生物大分子分离和纯化技术中极其重要的组成部分。目前以色谱技术分离纯化的产品越来越多，其中包括胰岛素、干扰素、疫苗、抗凝血因子、生长激素、酶等。 二、层析法的分类和特点 1、按流动相与固定相状态分类 由于流动相只可能是气体、液体和超临界状态流体，所以有气相色谱、液相色谱及超临界流体色谱之分。若再考虑固定相也只有两种状态（固态与液态），所以一共有五种色谱技术: 气相色谱：气-固色谱（吸附层析 GSC），气-液色谱（分配层析GLS） ?液相色谱： 液-固色谱（吸附层析），液-液色谱(分配层析) 超临界流体色谱： 2、按层析过程的物理化学原理分类 ①吸附色谱：固体表面对物质的物理吸附。 ②分配色谱：利用组分在两个互不相溶的相中的分配系数不同，以达到彼此分离的目的。 ③凝胶层析：利用混合物中分子大小的差异来分离物质的一种方法。 ④电泳层析：由于混合物中各组分所带电荷性质、电荷数量以及分子质量的不同，在同一电场作用下，各组分泳动的方向和速度不同而得以分开。 ⑤离子交换色谱 ⑥亲和色谱 3、按固定相的形态不同分类: ①柱层析:固定相装在一根管子中，采用柱管进行分离的层析。 ②纸层析:利用含水的滤纸做为固定相，在滤纸上直接展开。 ③薄层层析:将吸附剂研成粉末，再辅成薄膜，然后采用纸层析类似的操作进行层析。 柱层析的最大优点是分离效能高、分析速度快，定量较为可靠。纸层析和薄层层析的设备和操作较简单，易于普及。 4、根据分离操作方法，色谱法又可分为： 迎头法（前沿展开法） 顶替法（置换展开法） 洗脱分析法（洗脱展开法） 5、按色谱分离的规模分类 根据分离时一次进样量的多少，即色谱分离的规模可分为： 1、色谱分析规模（小于10mg） 2、半制备（10-50mg） 3、制备（0.1-1g） 4、工业生产（大于20g/d） 6、根据操作压力的不同分类 低压色谱（＜0.5MPa） 中压色谱（0.5-4.0MPa） 高压色谱（4