第六章目的基因获取和dna重组.pptVIP

第六章 基因工程产品制备技术过程 第一节 目的基因的获得 获得目的基因的方法：主要有4种 1．PCR扩增（包括逆转录法） 2．从基因文库中钓取 3．化学合成 4．基因的直接分离 一、基因合成技术 基因合成，指利用4种单体脱氧核糖核苷酸(Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ），通过化学反应，合成出一条与已知基因序列完全相同的DNA链。 基因合成实际使用的是脱氧核糖核苷三磷酸为合成原材料。 基因合成有许多方法。利用自动化的DNA合成仪是最简便的方法，但一次合成的长度约150～200bp，超过200bp的序列，就需分段合成，合成后再用连接酶连接。 基因化学合成的原理 基因合成实质是要在二个单核苷酸之间形成磷酸二酯键，使四种单核苷酸按照一定的顺序连接成DNA长链。由于合成DNA的单核苷酸都是多功能团化合物，任意两个单核苷酸如A与C，由于它们的分子结构只是碱基不同，而核糖和磷酸基完全一样，也就是说，它们均带有活性的3′端羟基（—OH）和5′端磷酸基（以下用“P”表示），这样发生化学反应时，既可以是A的3′—OH与C的5′—P反应形成磷酸二酯键，也可以是C的3′—OH与A的5′—P反应生成磷酸二酯键，反应的结果就会形成AC或CA两种结果。再如对于AGTCT链，如果要加上第5个核苷酸G，当G的5′—P与AGTCT第5位T的3′—OH反应形成磷酸二酯键，则合成的序列为AGTCTG；如果是G的3′—OH与AGTCT第一位A的5′—P反应生成磷酸二酯键，则合成的序列为GAGTCT。可见，为了生成特定的序列，合成基因必须采取适当的方法。 不同缩合方式形成的不同产物 磷酸二酯法的基本原理 为了保证合成反应能定向进行，使参加形成磷酸二酯键的单核苷酸按顺序连接，对参加反应的核苷酸将不需要参加反应的基团，用适当的保护基选择性的保护起来。保护反应的具体作法是，将一个大的保护基团，例如芳基磺酰氯(ArSO2Cl)或二环己基碳二亚胺(DCC)，加到脱氧核苷酸的5′端磷酸基或3′端羟基上，这样，具有5′端保护的单核苷酸，便只能够通过它的3′-OH同另一个3′端保护的单核苷酸的5′-OH之间定向的形成一个磷酸二酯键，从而使它们缩合形成两端都被保护的二核苷酸分子。 对不参加反应的集团加保护基 . ◆合成过程使用的保护基团，有些可以通过酸处理移去，有的可通过碱处理移去。所以不论是5′端的保护基团、还是3′端的保护基团，都可以通过酸或碱的脱保护，消除掉保护集团。这样的一个带有5′端保护的合成的二核苷酸分子，又可以同下一个带3′端保护的单核苷酸或二核苷酸进行第二次缩合反应，形成一个三核苷酸或四核苷酸分子，这种从缩合反应开始，到保护基团消除，进而再进行新的缩合反应的循环周期，可以反复进行许多次。 固相合成法 3、封端反应 加入乙酸酐，激发乙酰化作用，把所有没有参与偶联反应的5 ′端羟基全部封闭。 4、氧化作用 第2步缩合反应形成的亚磷酸三酯键十分活跃不稳定，利用碘液的催化作用，使其被氧化成为相当稳定的3 ′—5 ′磷酸三酯键。2个单核苷酸稳定的连接在一起。 重复以上步骤，进入下一个核苷酸的连接反应。 合成DNA片段的组装 DNA的合成能力：目前一次合成的长度局限于150-200bp，而绝大多数真核基因的长度都超过着这个范围，因此如果利用合成法，一般都是先合成几个短的片段，然后再组装成完整基因。（所以对于DNA链较长的基因，人们一般更愿意使用逆转录法获得目的基因） DNA片段的组装连接方法有2种： 第一种方法：粘末端连接法 二、 基因文库法获取目的基因 即直接从基因文库中分离目的基因 　　基因文库包括DNA文库和cDNA文库。 DNA文库：汇集了某一生物基因组所有DNA序列的重组体克隆群。 cDNA文库：利用纯化的mRNA在逆转录酶的作用下合成互补的cDNA，然后按构建DNA文库类似的方法对cDNA进行克隆，由此获得的克隆称cDNA文库。 构建基因文库是基因工程的任务之一。 构建基因文库是一项十分繁重的工作，一般的基因工程实验室都难以完成此项任务。 目前我国具有的完全基因组文库： 水稻基因组文库 人参基因组文库 人基因组文库 人cDNA文库 鼠功能基因组文库 1、构建一个基因组文库的克隆规模 以人的DNA文库为例： (1)人的基因组大小为30亿碱基对，即3×106kb. (2)常用的克隆载体质粒、λ噬菌体和COS质粒克隆外源DNA的能力分别为15kb、25kb和45kb. （3）选取克隆能力最大的COS质粒载体，则需要构建至少6.8万个克隆才可能包含整个人的基因组DNA 3×106kb/45 kb = 6.8 ×104 6.8万只是一个理论数，由于D