2011-现代组织化学技术2013418.pptVIP

Feulgen反应显示DNA 用稀盐酸处理切片，使DNA水解，打开脱氧核酸与嘌呤碱基之间的连接键（糖苷键），形成醛基，再与Schiff试剂作用，形成紫红色反应产物。 碘化丙啶（Propidium Iodide，PI） PI检测试剂盒可用于细胞凋亡检测，也可用于普通的细胞核染色以及某些特定情况下的双链DNA染色，染色后可用荧光显微镜检测或流式细胞仪检测。PI是一种DNA结合性染料，其激发和发射波长分别为488nm和630nm，产生红色荧光，但无膜通透性，不能透过活细胞膜，只能染死细胞。 The green is the microtubule network (part of the cell cytoskeleton) stained with an antibody to tubulin. The red is the nucleus stained with propidium iodide. 正常细胞： 不能着色 早期凋亡细胞：呈微弱红光 晚期凋亡细胞：红光加强 坏死细胞： 呈强红色荧光 在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸(PS)位于细胞膜内侧，一旦发生细胞凋亡，可以从细胞膜的内侧迅速翻转到细胞膜外侧，使得PS 暴露在细胞膜表面。 在Ca2+存在时，Annexin V 与PS 有很高的亲和力，可与之迅速结合。PS 外翻发生在细胞核破裂、DNA 片段化以及凋亡相关蛋白出现之前，这使得Annexin V 与PS 的结合成为凋亡早期的一种重要检测标志事件。 PI 被用来区分存活的早期细胞和坏死或晚期凋亡细胞。坏死细胞可以同时与annexin V-FITC 和PI 结合显色，而PI 则被排除在活细胞(FITC 阴性)和早期凋亡细胞(FITC 阳性)之外。 酶组织化学 酶组织化学基本反应原理 酶特异性底物 + 相关捕获剂 反应产物沉淀（有色） 反应产物沉淀（无色）+置换剂 酶 （孵育液内） （组织细胞内） 镜下观察 有色沉淀 酶组织化学是显示酶的活性 一、金属-金属盐显示法 方法Ⅱ：铅法 酶作用于底物时，其分解产物与底物混合液中某种物质结合，沉着在作用部位。然后结合物被金属置换，通过金属显色来证明酶的存在。或者，酶作用于底物后生成的分解产物，与底物孵育液中的金属离子相结合，直接沉着于酶反应部位，使其显色。 方法Ⅰ：钙-钴法 二、偶联偶氮色素法 1、同时偶联法： 该法是孵育液中的底物在酶作用下产生分解产物，后者立即与重氮盐结合（偶联偶氮反应），形成不溶性偶氮色素而显色。 2、后偶联法： 该法是为了防止重氮盐对酶的抑制作用，而 先使酶作用于底物，使其分解产生反应物沉淀， 然后将其浸渍于重氮盐溶液中，使其形成偶氮色 素而显色。 OPO2Ca OH N≡N Cl β-磷酸萘酚 α-萘基氯化重氮盐 不溶性偶氮色素 N=N OH 酶作用 三、色素形成法 1、四唑盐法 主要用于显示脱氢酶。底物中含有四唑盐或双四唑盐。在脱氢酶的作用下，底物释出氢原子，并与四唑盐或双四唑盐形成红色或蓝色的甲 （càn）或二甲 色素。 C6H5—C N—N—C6H5 N＝N—C6H5 酶作用 +2H C6H5—C N—NH—C6H5 N＝N—C6H5 + HCl 四唑盐(无色) 甲 （红色） Formazan dyes are artificial chromogenic products of the reduction of tetrazolium salts by dehydrogenases and reductases. They have a variety of colors from dark blue to deep red to orange, depending on the original tetrazolium salt used as the substrate for the reaction. 2、靛酚蓝法： H3C CH3 N N H3C CH3 N NH2 OH + 酶作用 + 2H2O 二甲基–对–苯二胺 ?-萘酚 靛酚 O O2 细胞色素氧化酶 过氧化物酶 酶组织化学注意事项 1.选择最适温度、pH值及缓冲液 2.为保持酶活性，最好使用冰冻切片，固定时间不能过长 3.有些物质能提高或抑制酶的活性，故要选择合适的捕捉剂 4.进行对照实验：用酶的抑制剂、用去底物的孵育液、用已确定含该酶的组织细胞进行对照 几种酶的反应原理 碱性磷酸酶 酸性磷酸酶 三磷