三氧化二砷抗肝癌血管新生作用论文.docVIP

　　三氧化二砷抗肝癌血管新生作用论文 【摘要】 目的： 探讨三氧化二砷（As2O3）注射液抗肝癌血管新生的作用及其相关机制。方法： 采用MTT法、透射电镜观察、免疫组化、鸡胚尿囊膜（CAM）血管形成实验等方法，观察As2O3注射液对人肝癌细胞株SMMC7721和人脐静脉内皮细胞ECV304生长、超微结构、血管内皮生长因子（VEGF）和表皮生长因子受体（EGFR）蛋白表达以及对CAM血管形成的影响。结果： As2O3能显著抑制人肝癌细胞SMMC7721和人脐静脉内皮细胞ECV304生长，用药后诱导其出现了典型的细胞凋亡超微结构改变；As2O3对SMMC7721细胞和ECV304细胞VEGF、 EGFR的表达均有抑制作用；As2O3能抑制CAM血管形成。结论： As2O3注射液具有显著抗肝癌血管新生作用，其机制与抑制血管内皮细胞生长、诱导血管内皮细胞凋亡、调控肿瘤血管新生相关因子VEGF和EGFR的表达密切相关。 【关键词】 三氧化二砷 肝癌 血管生成 自20世纪70年代以来，人们已发现肿瘤的生长有赖于血管新生，肿瘤组织中的新生血管不仅为瘤体提供氧分，而且为肿瘤转移及血管浸润提供通道，故血管新生与肿瘤生长、转移密切相关［1］。进一步的研究证实.freela产品。 1.3 细胞形态学观察 1.3.1 倒置显微镜观察 取对数生长期的细胞按1×109L-1接种于培养瓶中，待细胞完全贴壁后加药处理(As2O3终浓度分别为1、2、4mg·L-1)，对照组加入等体积的培养液，然后培养至预定时间，用倒置显微镜观察细胞生长状况和形态学改变。 1.3.2 透射电镜观察 取对数生长期的人脐静脉内皮细胞ECV304按1×109L-1接种于培养瓶中，待细胞完全贴壁后，给药组加入不同浓度的药物，对照组加入等体积的培养液，继续培养。加药后48h收集细胞，4%戊二醛固定2h，0.1mol·L-1磷酸缓冲液漂洗，1%四氧化锇作用后固定，梯度酒精脱水，Epon812包埋剂包埋，切片机切成薄片（切片厚度在50nm左右），醋酸铀和柠檬酸铅双染色，透射电镜观察。 1.4 细胞生长检测 取3×107L-1的活细胞接种于96孔培养板中，每孔100μl，设4复孔，待细胞贴壁后分别加入不同浓度的As2O3溶液，100μl·孔-1，对照孔加入100μl培养液。置于37℃，5%CO2培养箱中培养至预定时间，每孔加入100μl0.04mol·Ｌ－１盐酸异丙醇，微型振荡器振荡5～10min使结晶完全溶解，在酶联仪波长570nm处测定各孔吸光度（OD）值，按下列公式计算细胞生长抑制率：抑制率（%）=（1-加药孔平均OD值/对照孔平均OD值）×100%。实验重复3次。 1.5 免疫组化检测 按SP免疫组化试剂盒说明书操作，观察细胞VEGF和EGFR蛋白的表达情况。 1.6 鸡胚尿囊膜(CAM)血管新生 取种鸡场孵化的7日龄胚蛋，随机分为2组，每组25只蛋。在照卵灯下寻找胚头右下方血管稀少区，划定1cm×1cm圆形开窗位置，在鸡胚气室端钻直径1mm小孔并穿透壳膜。用75%乙醇消毒开窗部位，使用手术剪轻轻揭去蛋壳及壳膜，暴露出CAM，将甲基纤维素碟放置于CAM上血管较少的部位，用微量进样器将各组药物滴入甲基纤维素碟中。处理方法：As2O3组浓度20mg· L-1、阴性对照组用生理盐水，各组滴入量20μl。加药后用无菌透明胶带封窗，放入孵化箱继续孵化。3d后揭去透明胶带，加入适量甲醇、丙酮等量混合固定液，在室温下固定15min。然后以甲基纤维素碟为中心剪取3cm的CAM，放入盛有水的平皿中展开后平铺于滤纸上制成CAM标本。于解剖显微镜下观察用药区血管新生情况。甲基纤维素覆盖区及周围血管形成正常为(－),甲基纤维素覆盖区无血管或血管明显稀少且4mm≤直径≤6mm为阳性（+）,直径＞6mm为强阳性（++）。根据这一评定标准，计算出经药物作用的ＣＡＭ血管受到抑制（+）的百分率。 1.7 统计学方法 采用SAS8.0统计软件，计量资料用方差分析，计数资料用秩和检验,以Ｐ 0.05为有统计学意义。 2 结 果 2.1 形态学观察 倒置显微镜下观察不同浓度As2O3注射液作用于SMMC7721和ECV304细胞后，用药各组细胞随着药物处理时间的延长，细胞增殖逐渐受到抑制；部分细胞变圆、脱壁，细胞间接触变松，胞浆中颗粒增多，细胞周围出现碎片，部分细胞死亡后漂浮在培养液中。而未加药的对照组细胞呈上皮型贴壁生长，细胞轮廓清楚，细胞间接触紧密，细胞生长旺盛，见图1。 透射电镜下观察经As2O3注射液作用于SMMC7721和ECV304细胞48h后，镜下均发现大部分细胞出现不同程度的改变，部分细胞呈现退行性改变，胞质中线粒体肿胀、嵴消失、空泡化，胞质疏松，出现大小不一的空泡