一氧化氮及其合酶在杀伤肿瘤细胞中的作用论文.docVIP

　　一氧化氮及其合酶在杀伤肿瘤细胞中的作用论文 关键词：巨噬细胞肺泡一氧化氮合酶肿瘤 活化的巨噬细胞(M)在抗肿瘤过程中具有十分重要的意义。一氧化氮(NO)作为活化的M的细胞毒效应分子之一，在杀伤肿瘤效应中起重要作用［1］。本研究通过测定肺M内诱导型一氧化氮合酶（iNOS）及其产物NO水平，并应用特异性NOS抑制剂来观察肺M对肿瘤细胞杀伤作用的影响，旨在探讨肺MNOS活性与肿瘤杀伤力之间的关系，以阐明肺M在抗肿瘤免疫中的地位。 1 材料和方法 1.1 肺M的制备及培养 体质量20～25g的纯种C57雄性小鼠32只，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司,随机分成实验组和对照组，每组16只，均经腹腔注入2%戊巴比妥钠麻醉,腹主动脉放血处死,暴露颈部气管后,用37℃生理盐水进行支气管肺泡灌洗,每次1ml,共15次。将回收的灌洗液以1500r/min离心10min,弃上清,用含10%小牛血清的最低必需培养液(MEM)配成1×106个/ml的细胞悬液。将细胞悬液接种于96孔板中,37℃,5%CO2培养2h,洗去未贴壁细胞,根据需要分别加入不同剂量(50.freell)的干扰素γ（INFγ）,.freell的密度培养在RPMI1640培养液中,置37℃,5%CO2培养箱培养48h,2500r/min离心20min,取上清液,置-20℃保存待用。 1.3 iNOS活性测定 用Smith薄层层析法［2］测定上清液培养标本中瓜氨酸(citrulline)的生成量，以此反映iNOS的活性。 1.4 NO测定 10mmol/L硼酸钠溶液系列稀释10mmol/L亚硝酸钠，测定其相应于波长为545nm时的光密度(D)值,作曲线,并得出直线回归方程式［3］。取上清培养液，加入等量的Greiss试剂（1%磺胺、0.1%萘乙二胺、2.5%磷酸),室温放置10min，545nm比色，根据直线回归方程计算出NO含量。 1.5 肺M肿瘤杀伤活性测定 在培养板内加入肺M悬液100μl/孔，实验组再加入2mmol/LNG单甲基左旋精氨酸（L-NMMA，Sigma公司），50μl/孔，置37℃，5%CO2培养箱培养4h，再加入含10%P815上清液的营养液100μl/孔，置37℃,5％CO2培养72h。每孔加二甲基亚砜(DMSO)100μl,混匀静置20min,在PG-3022酶联仪上用570nm波长测定D值,计算肿瘤细胞生长抑制率。 1.6 统计学处理 所有数据采用X±s表示，组间显著性检验用配对资料t检验，各指标进行直线相关分析。 2 结果 2.1 不同剂量INFγ对肺M产生NO的影响 不同剂量的INFγ与活化的肺M共同培养24h后,培养液中NO含量随着INFγ剂量的增加而升高(图1),且呈明显的剂量依赖关系(r=0.985,t=19.89,P＜0.01)。 图1 INFγ对肺巨噬细胞NO产生和iNOS活性的影响 fig1 TheeffectofINFγonNOproductionand activityofiNOSbymacrophages ●:NO;▲:iNOS 2.2 INFγ对肺MNOS活性的影响 不同剂量INFγ作用于肺M后，肺MiNOS活性随INFγ剂量的增加而升高（图1）,与INFγ的剂量有明显的相关性(r=0.990,t=19.78，P＜0.01)。 2.3 L-NMMA对肺M肿瘤杀伤活性的影响 活化的肺M与P815单独作用时，其培养上清液中NO的浓度为(18.47±5.00)μmol/L，而预先加入L-NMMA再培养的上清液中NO浓度为(11.07±4.06)μmol/L，两组之间有显著性差异(P＜0.05)；未加L-NMMA组肺M对P815细胞生长的抑制率为66.6%，预先加入L-NMMA组为43.3%，较前者明显降低［两组D(570)值分别为0.132±0.032和0.292±0.065，P＜0.05］。 3 讨论 NO由L-精氨酸经NOS作用而生成。NOS主要有两种同工酶：结构型(constitutive,cNOS)和诱导型（inducible,iNOS)。M、库普弗细胞是iNOS的主要表达细胞，因此从肺M内测得的为iNOS［4］。某些细胞因子，如INFγ、TNFα、IL-2等可诱导iNOS的活性，增加NO的合成［5］。 活化的M具有杀伤肿瘤细胞的能力,其作用机制是多样的,可能是通过细胞间的联接或是依赖于一种或多种细胞毒效应分子，包括IL-2、过氧化氢、TNF等。自1985年发现活化的M可产生NO以来［6］，随着有关NO研究的深入，越来越多的结果表明NO与活化M杀伤肿瘤细胞的作用密切相关。Hibbs等［7］首先发现在缺乏精氨酸的培养条件下，活化的M的细胞毒效应作用不能表