菟丝子、莱菔子与其易混淆品快速PCR法鉴别探讨.docVIP

菟丝子、莱菔子与其易混淆品的快速PCR法鉴别研究 　　[摘要]完善快速PCR鉴定检测体系，并建立菟丝子或莱菔子的分子鉴别方法。收集不同地区的菟丝子、莱菔子及其易混淆品材料，所有样品进行总DNA的提取，通过对菟丝子、莱菔子及其易混淆样品ITS片段进行扩增、测序，进行同源比对后根据其变异位点设计特异性鉴别引物，采用2步法进行PCR扩增，从而对菟丝子或莱菔子进行鉴别。通过对影响PCR退火温度、变性温度、退火时间、变性时间、循环次数等因素进行优化，并对不同型号PCR仪进行考察，分别获得菟丝子、莱菔子快速PCR反应程序。在稀释后的PCR产物中加入SYBR Green I染料，正品显示出明亮绿色荧光，而混淆品不显示荧光，且可有效的避免因引物二聚体而存在的假阳性问题。快速PCR方法可以简单快速鉴别菟丝子、莱菔子，为实现药材分子鉴别的现场运用提供技术支撑 [关键词]快速PCR；菟丝子；莱菔子；分子鉴定；荧光检测 据2010年版《中国药典》一部记载，菟丝子来源为旋花科植物南方菟丝子cuscuta australis R.Br.或菟丝子C.chiinensis Lm的干燥成熟种子。莱菔子来源为十字花科植物萝卜Raphanus sativus L.的干燥成熟种子。由于近年对菟丝子、莱菔子需求量不断增加，常以其他植物种子如欧白芥、油莱等掺杂，且菟丝子与莱菔子间也常出现混淆使用，严重影响了药材的安全使用。由于种子的形态比较相近，利用传统鉴别方法不易区分，因此需要建立更加快速、准确的鉴别方法 不同研究学者分别采用薄层色谱法、红外光谱法、高效液相色谱法、聚丙烯酰胺凝胶电泳技术、显微方法等对菟丝子或莱菔子进行鉴定，但这些方法比较繁琐，不利于推广。快速PCR技术被认为可满足现代中药分子鉴别快速、准确、高通量鉴别的核心需要，目前该方法已成功用于金银花、蛇类药材等中药材的真伪鉴别 选择合适的DNA鉴别片段是开展快速PCR鉴别方法研究的前提，菟丝子rDNA ITS序列、欧洲菟丝子核基因ITS等序列已报道。本文在此基础上，建立了菟丝子、莱菔子及其常见混伪品的快速PCR鉴别方法，并引入了荧光染料法对真伪鉴别结果进行检测，且解决了引物二聚体对鉴定结果准确性的影响，大大提高鉴别反应时间和效率，为实现药材分子鉴别的现场运用提供技术支撑 1 材料和方法 1.1 药材 收集来自于不同地区的菟丝子、白芥子、莱菔子、紫苏子、青葙子、沙苑子、急性子、冬葵子、油菜子。以上样品采集自云南、重庆、安徽、广西等地区，经中国中医科学院中药资源中心金艳助理研究员鉴定，凭证标本保存于中国中医科学院中药资源中心，见表1 1.2 仪器 GeneAmp 9700型PCR扩增仪（Applied Biosvs-tem公司）；TC-512梯度PCR仪（TECHNE公司）；Veriti96孔梯度PCR扩增仪（Applied Biosvstems公司）；5810 R型高速冷冻离心机（Eppendoff公司）；VORTEX-2 GENIE漩涡震荡仪（Scientific in-dustries公司）；DYY-12型电脑三恒多用电泳仪（北京六一仪器厂）；HE99X-15-1.5型电泳槽（Hoefer公司）；SYNGENE凝胶成像系统（GENE公司）；ZF-7A型手持式紫外灯（上海谷村电子光学仪器厂） 1.3 试剂 琼脂糖购自Promega公司；溴化乙啶购自Fluka公司；EX Taq DNA聚合酶、SpeedStar HS Taq DNA聚合酶、DL 2000 DNA Marker购自Takara公司；10000×SYBR Green I购自Invitrogen公司；其他试剂均为国产分析纯 1.4 基因组总DNA的提取及PCR扩增、测序 取适量的样品（约0.03g），研磨成细粉后，采用改良的CTAB法提取总DNA，获得的DNA于-20℃保存备用。选择通用引物ITS对样品进行扩增，反应程序见表2。反应体系总体积为20μL，包括10×buffer缓冲液2μL，dNTP1.6μL，引物各0.5μL，EX Taq0.2μL，DNA 0.5μL，灭菌蒸馏水14.7μL。PCR反应条件见表2。反应结束后在PCR体系中加入5μL6×loading buffer，混匀后于EB染色的1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，SYNGENE凝胶成像系统观察、成像。选择阳性PCR产物样品进行双向测序 1.5 菟丝子和莱菔子鉴别引物设计 将测序所得序列去除引物序列，去除引物后的序列使用BioEdit分析软件进行进行分析、校对处理后，与GenBank下载菟丝子序列（GenBank登录号JF708205，AY558824，KJ025065，EF194670）、莱菔子序列（GenBank登