功能蛋白质组学研究方法课件1.pptVIP

功能蛋白质组学 功能蛋白质组学是指对蛋白质间、蛋白质与DNA/RNA 间的相互作用的研究。以细胞内与某个功能有关或某种条件下的一群蛋白质为主要研究内容， 由此建立细胞内外信号传递的复杂网络。 蛋白质芯片技术 噬菌体展示技术 酵母双杂交系统 蛋白质芯片 蛋白质芯片是将大量蛋白质分子按预先设置的排列固定于一种载体表面，形成微阵列，根据蛋白质分子间特异性结合的原理，构建微流体生物化学分析系统，以实现对生物分子的准确、快速、大信息量的检测。 依据被检测蛋白样品的标记种类来选择不同的检测设备对蛋白质芯片反应结果的检测。荧光标记是芯片息采集中使用最多也是最成功的报告标志。杂交反后的芯片上各个反应点的荧光位置、荧光强弱经过芯片扫描仪和相关软件可以进行分析，将荧光信号转成数据，即可获得有关生物信息。 蛋白质芯片分类 根据固定介质的不同,可以分为两大类: 化学型蛋白质芯片（SELDI-TOF-MS蛋白质芯片） 生物型蛋白质芯片（如抗体、受体、配体等）； 根据片基材料的不同可以分为： 膜芯片、玻璃芯片和液相芯片等。 目前常用蛋白质芯片有： 1. SELDI-TOF-MS蛋白质芯片 2. 抗体芯片 3. 靶蛋白质芯片 4. 液相蛋白质芯片 SELDI-TOF-MS蛋白质芯片 表面加强激光解吸电离-飞行时间质谱(surface enhanced laser desorption /ionization time of flight-mass spectrometry，SELDI-TOF-MS ）蛋白质芯片由３部分组成：蛋白质芯片、阅读器和分析软件。 蛋白质芯片是核心部分，芯片上固定的介质可以是阴离子、阳离子、疏水性、亲水性、金属等，根据蛋白质的化学特性而有选择性地捕获特异的蛋白质。 ＳＥＬＤＩ技术的基本原理: 将待测样品(血清、尿液、分泌液、细胞裂解液等)滴到芯片表面，通过亲合作用样品中的某些蛋白质被吸附到芯片的固相基质表面上，用缓冲液洗去芯片上的杂质蛋白和其他污染物，然后在芯片上加入能量吸收分子（energy absorbing molecular,EAM），芯片干燥后，在真空管中用激光轰击，蛋白质在吸收能量后被解析发生离子化， 在电场力作用下脱离芯片表面， 被离子检测器所检测。检测结果经过软件分析处理后， 可绘制出质谱图，显示相关蛋白质的分子量、含量等信息。 抗体芯片 抗体芯片主要研究在不同生理或病理状态下蛋白质水平的量变。微型化、集成化、高通量化是抗体芯片重要特点。 芯片上排列了许多已知蛋白质的单克隆抗体，这些单克隆抗体对应的蛋白质（抗原）都是细胞结构和功能上十分重要的蛋白，涉及信号传导、肿瘤、细胞周期调控、细胞结构、细胞凋亡等广泛的领域。 抗体芯片检测的结果不是蛋白质的绝对含量而是目的蛋白质在两个样品之间的相对峰度。 靶蛋白质芯片 主要用于蛋白质相互作用研究、蛋白表达研究和小分子蛋白结合研究。 液相蛋白质芯片 是一种新型的、高度灵活的多元蛋白质研究平台。 液相芯片体系由许多不同的小球体为主要基质，每种小球体上固定有不同的探针分子，将这些小球体悬浮于一个液相体系中，就构成了一个液相蛋白质芯片系统。在液相系统中，为了区分不同的探针，在球形基质的制造过程当中，掺入了两种不同的红色分类荧光，根据这两种红色分类荧光的比例不同(色彩编号)，区分不同的探针。 可同时固定各种蛋白质、多肽、核酸等生物分子，可以对同一个样品中的多个不同的分子同时进行检测。 噬菌体展示技术 这一技术有效地实现了基因型和表型的体外转换，即在二者之间架起了联结的桥梁，使得研究者完全可以在分子克隆的基础上，有效地实现蛋白质构象的体外控制，从而可以在体外获得具有良好生物学活性的表达产物。 Navagen公司用T7噬菌体构建的各种cDNA表达文库，将外源基因序列插入到编码T7噬菌体包膜蛋白基因中所表达的多肽或蛋白质以与噬菌体包膜蛋白融合的形式展示在噬菌体表面。 T7噬菌体展示文库可以展示相当部分表达的蛋白质，甚至可以保持蛋白的一定构象。因此，该系统最大程度地再现了细胞内的真实情况，所筛选出的结合蛋白与自然状态较为接近。目前已被成功应用于蛋白质-蛋白质、抗原-抗体以及DNA-蛋白质之间作用的研究，为功能基因组学的研究提供了一种新的方法。 cDNA库是在噬菌体衣壳蛋白的基因中插入从某些组织或细胞中抽提出来的mRNA的互补DNA片段，从而表达该组织或细胞的各种蛋白于噬菌体的表面。 如：抗体库的构建 表达载体噬菌粒pCANTAB 5E 噬菌体展示技术的应用 1