第十章 基因工程导论课件1.pptVIP

C 基因工程的理论基础 A 基本定义 B 基因工程的基本形式 C 重组DNA技术的理论基础 A 用于核酸操作的工具酶 C 用于基因转移的受体菌或细胞 A DNA的体外重组（切与接） B 重组DNA分子的转化和扩增（转与增） C 转化子的筛选和鉴定（检） 核酸分子杂交 Southern杂交－检测DNA A 鸟枪法 B cDNA法 E 基因文库的构建 cDNA第二链的合成 煮沸 NaOH 自身引导法：获得的双链cDNA 5’端会有几对碱基缺失 AAAAAAAAAAAAAA 5‘ppp’5 G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTT OH 3’ Klenow dNTPs S1 cDNA第二链的合成 DNApol dNTPs RNaesH 置换合成法：获得的双链cDNA 5’端也会有几对碱基缺失 5‘ppp’5 G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ AAAAAAAAAAAAAAp 5’ 5’ S1 AAAATTTOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ 5’ TTTTTTTTTTTTTTOH 3’ AAAAAAAAAAAAAA 5’ 5’ TTTTTTTTTTTTTT 3’ 3’ T4-DNA ligase cDNA第二链的合成 dCTP TdT 引导合成法：获得的双链cDNA 能保留完整的5’端序列 5‘ppp’5 G G AAAAAOH 3’ TTTTTp 5’ 3‘ HO 5‘ppp’5 G G AAAAACCCCCCCOH 3’ 3‘ HOCCCCCCC TTTTTp 5’ 3‘ HOCCCCCCC TTTTTp 5’ 3‘ HOCCCCCCC TTTTTp 5’ 5‘ pGGGGGGG 3‘ HOCCCCCCC TTTTTp 5’ 5‘ pGGGGGGG AAAAAOH 3’ NaOH 退火 Klenow dNTPs cDNA法克隆目的基因的基本战略 双链cDNA的克隆 双链平头的cDNA通常可以使用下列三种方法克隆入载体中： 平头末端直接与载体连接，但插入的片段无法回收 平头两端分别接同聚物尾，最好是AT同聚物尾，这样重组 分子可通过加热局部变性和S1核酸酶处理回收插入片段 加装人工接头引入酶切口，以便插入片段回收 cDNA法克隆目的基因的局限性 并非所有的mRNA分子都具有polyA结构 细菌或原核生物的mRNA半衰期很短 mRNA在细胞中含量少，对酶和碱极为敏感， 分离纯化困难 仅限于克隆蛋白质编码基因 噬菌体或病毒DNA 大肠杆菌的 l 噬菌体DNA l-DNA载体的构建：缩短长度 野生型l-DNA包装的上限为51kb，本身长度为48.5kb，只有当插入的外源DNA片段不大于2.5kb时，才能被包装成有感染力的噬菌体颗粒。因此缩短野生型l-DNA的长度，可以提高装载量。其实野生型l-DNA上约有40-50%的片段是复制和裂解所非必需的。根据切除的多少，可将l-DNA分成两大类载体： 插入型载体 取代型载体 噬菌体或病毒DNA 大肠杆菌的 l 噬菌体DNA l-DNA载体的构建：缩短长度 插入型载体 体外包装 插入位点 体外包装 插入片段 载体长度 37 kb 插入片段大小： 0 - 14 kb （51 – 37） 噬菌体或病毒DNA 大肠杆菌的 l 噬菌体DNA l-DNA载体的构建：缩短长度 取代型载体 体外包装 体外包装 插入片段 最小装载长度 10 kb （51 – 26） 载体长度 26 kb 插入片段 最大装载长度 25 kb （36 – 26） 噬菌体或病毒DNA 大肠杆菌的 l 噬菌体DNA l-DNA重组分子的体外包装： l-DNA重组分子需在体外人工包装成有感染力的噬菌体重组颗粒，方可高效导入受体细胞 用于体外包装的蛋白质可直接从感染了l噬菌体的大肠杆菌中提取，现已商品化。这些包装蛋白通常分为相互互补的两部分：一部分缺少E组份，另一部分则缺少D组份。包装时，当且仅当这两部分包装蛋白与重组l-DNA分子混合后，包装才能有效进行，任何一种蛋白包装液被重组l-DNA污染后，均不能被包装成有感染力的噬菌体颗粒，这也是基于安全而设计的 考斯质粒 考斯质粒（cosmid） 考斯质粒载体的构建： 考斯质粒是一类人工构建的含有 1978年Collins和Hohn发明构建 pHC79 6400 bp Tcr l fragment cos ori Apr PstI Bam