蒋-2016秋-dna重组及重组dna技术.ppt

* * The repressor binds independently to the two operators. It has a single function at OL, but has dual functions at OR. These are illustrated in the upper part of Figure 11.14. 抑制子独立地与两个操纵子联结，它在OL端中有一个功能，而在OR端则有两重功能。在图13.13（溶源性是由一个自发育路线维持的[上半部]。如果路线被打断，将启动裂解路线[下半部]。）上半部有说明。 在OL处，抑制子的效果与我们已讨论过的其它系统中的效果一样：阻碍RNA聚合酶在RL端初始化转录。这终止N基因的表达。所有向左方的早期基因转录都要用到PL。因此这个反应阻止了所有左向的早期基因单元的表达。这样在裂解周期还没有走出早期就被阻挡住了。 在OR端，抑制子的结合阻止了对PR的作用。这样cro基因和其它右向的早期基因就不表达。（我们在后面将讲到为什么在开始支持溶源性时阻碍Cro的表达是很重要的）。 但在OR端上的抑制子有另一个效果，合成这个抑制子的启动子，PRM相邻地排在OR右端。这表明RNA聚合酶只有在抑制子与OR结合时才能有效地在PRM处启动。抑制子则作为CI基因转录所必须的正调节蛋白。抑制子本身是由CI产生的，因此这个反应就造成了一个正反馈的自发育路线，在这里抑制子的存在是支持自己继续合成所必需的。 这种控制路线的性质解释了溶源性存在的生物学特性。这条控制路线保证了溶原性的稳定，只需抑制子的水平是足够的就会有CI基因的持续表达。结果是，OL和OR仍被占据着。通过抑制整个裂解级联，这个反应支持原噬菌体处在不明确的惰性状态。 抑制子的存在解释了“免疫”现象的存在。如果第二个入噬菌体DNA 进入一个溶源性细胞，由已经存在的原噬菌体基因合成的抑制子蛋白将立即级联到新来的OL和OR基因上。这将阻止第二个噬菌体进入裂解周期。 起初，用致命突变入vir确认出操纵子是抑制子的结合目标。这一突变阻碍抑制子与OL或OR的结合，结果是噬菌体感染了一个新的宿主细菌后不可逆转地向裂解旁路发展。入vir突变体可以在溶源性细菌中生长。因为在OL及OR上的致命突变使新来的噬菌体忽略了抑制子的存在而进入裂解周期。噬菌体中致命突变等同于细菌操纵子的操纵基因组成突变。 * * * * 1. 借助载体上的遗传标志进行筛选 (1) 利用抗生素抗性标志筛选 (2) 利用基因的插入失活/插入表达 特性筛选 (3) 利用标志补救筛选 (4)利用噬菌体的包装特性进行筛选 （五）重组体的筛选与鉴定——筛 插入失活筛选带有重组载体的克隆 α 互补的检测 噬菌体 替换型： 重组λDNA长度达到野生型的75%～105%时，能包装成噬菌体颗粒感染宿主菌，呈现清晰的噬斑. 插入型： λgt10 ：外源基因插入CI基因，使其失活，消除溶原作用，形成透明噬菌斑，未重组者形成浑浊噬菌斑。 λgt11；含有lac Z基因， 重组使lac Z基因失活，在含X-gal培养基中形成白斑，未重组者形成蓝斑。 2. 序列特异性筛选 (1) RE酶切法 (2) PCR法 (3) 核酸杂交法 (4) DNA测序法 3. 亲和筛选法 1 Kb+ ladder 2 Positive clones digested with different restriction enzymes Empty vector Restriction mapping 菌落或噬斑原位杂交筛选重组体 * Sequencing 重组DNA技术操作过程可形象归纳为： 小结 分 分离获取目的基因 选 载体的选择与构建 接 目的DNA与载体连接 转 重组DNA转入受体细胞 筛 重组体的筛选与鉴定 重组DNA技术操作的主要步骤 载体 质粒 噬菌体 病毒 目的基因（外源基因） 基因组DNA cDNA 人工合成 PCR产物 限制酶消化 开环载体DNA 目的基因 连接酶 重组体 转化 体外包装，转染 带重组体的宿主 筛选 表型筛选 酶切电泳鉴定 菌落原位杂交 表达体系的建立： 表达载体的构建 受体细胞的建立 表达产物的分离纯化 （六）克隆基因的表达 标准：选择标志 强启动子 翻译调控序列 多接头克隆位点 E.coli表达体系的不足： 不宜表达真核基因组DNA； 不能加工表达的真核蛋白质； 表达的蛋白质常形成不溶性包涵体(inclusion body) ； 很难表达大量可溶性蛋白。 1. 原核表达体系 (E.coli表达体系最为