药物筛选靶点蛋白2009-514.pptVIP

药物筛选靶点蛋白的基因克隆与表达Gene cloning and expression of the target proteins for drug screening 中国医学科学院 北京协和医学院 药物研究所 朱 平 Why doing it? Requirements of drug screening (e.g. HTS) , especially on molecular or cellular level ★药物筛选模型是新药发现的基础，分子和细胞水平的筛选模型是药物高通量筛选的核心内容，蛋白质靶点（酶、受体等）是最为常见的分子靶点，有些比较容易得到，而另外一些则难以用常规方法获取，借助基因克隆与表达技术可以解决后者的来源问题。 ★新靶点的发现（包括将已知功能蛋白用于药物靶点的研究）是创新，充分利用已发现的“好”靶点，尤其是近年来发现并正在用于新药研发（如进入Ⅱ/Ⅲ临床）的靶点进一步发现新化合物也是一种创新，而且这种创新往往是投资少、见效快。 Cloning strategies 附：表观遗传学(epigenetics) 当然，有些遗传现象则无法用“中心法则”来解释清楚，也不符合孟德尔定律，简言之，有许多调控基因的信息，它们虽然本身不改变基因的序列，但是可以通过基因修饰，蛋白质与蛋白质、DNA和其它分子的相互作用，而影响和调节基因的功能和特性，并且通过细胞分裂和增殖周期影响遗传。（例：X染色体失活） 表观遗传学(epigenetics) 则是指基于非基因序列改变所致基因表达水平变化, 如DNA甲基化、RNA干扰、组蛋白修饰和染色质改型等都可引起上述变化。 从 RNA 等信息入手克隆和表达 药物靶点蛋白基因 (RT-PCR方法） 基本程序 一、收集信息 可以从GenBank等数据库得到有关信息，尤其是mRNA(cDNA)和蛋白质一级结构的信息。 现以“凝集素样氧化型低密度脂蛋白受体”（lectin-like oxidized low density lipoprotein receptor-1)为例， 打开NCBI (National Center for Biotechnology Information) HomePage: 说明：在GenBank中注册的mRNA序列是以单链 DNA形式表示的 二、 引物设计 5TGATGATGACT3 5TGATGATGACT···············AGAGCACAGTGAAG3 3ACTACTACTGA ···············TCTCGTGTCACTTC5 3TCTCGTGTCACTTC5 Primer Design 一般性原则 长度： 15~30bp G+C含量：40~75%之间 [Tm=4（G+C）+2（A+T）] 碱基分布的随机性：避免连续出现4个以上的单一碱基，尤其不要在3’端出现超过3个的连续G或C 引物自身：不能含有自身互补序列 引物之间：不能有多于4个的互补碱基，尤其在3’端 特异性：与非特异性序列的同源性小于70%，或少于连续8个的互补碱基 引物3?端：一般地不应发生错配，最好选G、C或A，尽可能避免选T，尤其是2个以上的T 5 ′ - Primer Design ◆特别注意：引物设计要兼顾拟定的表达载体插入位点上下游序列，如该处为信号肽等序列，新增序列则与前面的序列呈融合蛋白状态，要确保插入的序列不移码，之前无终止密码子！ TTGAATTTGGAAATGACTTTTGATG YL1: 5’-GGAATTCGAAATGACTTTTGATG-3’ EcoR I 3 ′ - Primer Design 注意：终止密码子的正确位置！ YL2: Not I His -tag 5 ′ –GGCGGCCGCTCAGTGGTGGTGGTG GTGGTGCTGTGCTCTTAGGTTTGCCT-3 ′ 三、Cell Culture and Total RNA Isolation ■For LOX-1, THP-1 cells were incubated with 50 μM histamine for 3h at 37℃ in PRMI 1640 medium prior to RNA isolation. ■Using TRIzol reagent (Invitrogen,