蛋白质组学与分析技术课第七讲.ppt

蛋白质组学与分析技术（第七讲） PCR 技术 基因克隆 邱德文 中国农科院植物保护研究所 2008.4.9 蛋白质和多肽的氨基酸序列测定 N端分析原理 N端蛋白质序列仪 测序前样品处理 C端序列分析 C端蛋白质序列仪 C端测`序的样品前处理 蛋白基因克隆：PCR扩增：不同引物随机组合扩增基因组统计表 3 、PCR扩增和化学合成  PCR技术（polymerase chain reaction）技术能把单个目的基因大量扩增，这个方法必须在已知基因序列或已知该基因所翻译的氨基酸序列。进而推断出因序列的情况下使用。 25ul PCR反应体系 总量 25ul 10×BUFFER 2.5ul dNTP(20mmol/L) 2.0ul P1 (2.5umol/L) 1.0ul P2 (2.5umol/L) 1.0ul 模板 1-2ul 酶 (5U/ul) 0.2ul 灭菌水 17.8-16.8ul PCR的每次扩增循环包括三步: 1 变性,在高温下把双链靶DNA拆开； 2 在较低的温度下使引物与靶DNA互补； 3 在中间温度下，在DNA多聚酶作用下，引物按模板DNA延长。 典型的PCR包括30～50循环，如此重复循环，使被扩增的靶核苷酸以几何级数扩增。 聚合酶链式反应(PCR) 反转录 PCR（reverse transcriptase PCR,RT PCR） 这种方法指的是以RNA为模板，经逆转录获得与RNA互补的DNA链即cDNA，然后以cDNA链为模板进行的PCR反应。 锚定 PCR（anchored PCR） 锚定PCR特别适合于扩增那些只知道一端序列的目的DNA。例如，对于一端序列已知、一端序列未知的DNA片段，可以通过DNA末端转移酶给未知序列的那一端加上一段多聚dG的尾巴，然后分别用多聚dC和已知的序列作为引物进行PCR扩增。 反向 PCR（ inverse PCR） 反向PCR特别适用于扩增已知序列的两端的未知序列。其具体方法是选择一个在已知序列中没有，而在其两侧都存在的限制性内切酶位点，用相应的限制性内切酶酶解后，将酶切的片段在连接酶的作用下环化，使得已知序列位于环状分子上。根据已知序列的两端序列设计两个引物，以环状分子为模板进行PCR，就可以扩增出已知序列两侧的未知序列。 热启动PCR（Hot-start PCR） 热启动PCR是提高PCR特异性最重要的方法之一。尽管Taq DNA聚合酶的最佳延伸温度在72℃，聚合酶在室温仍然有活性。因此，在进行PCR反应过程中，以及在热循环刚开始，保温温度低于退火温度时会产生非特异性的产物，这些非特异性产物一旦形成，就会被有效扩增。在用于引物设计的位点因为遗传元件的定位而受限时，如定点突变、表达克隆或用于DNA工程的遗传元件的构建和操作，热启动PCR尤为有效。 热启动PCR通过在第一个循环中等达到变性温度后，才加入PCR反应中的一两种关键成分，从而抑制了引物与模板的非特异结合，提高了反应特异性，除此之外，它与常规PCR反应完全一样。 降落PCR（TD PCR） 降落PCR是一种简单有效的PCR优化方法，尤其适用于退火温度不易掌握的情况。其策略是设计多循环的反应程序，选择高于熔解温度的起始退火温度，随后的循环中退火温度逐渐降低。由此，既保证了PCR产物的特异性，又保证了一定的扩增效率。通常降落PCR退火温度的范围应跨越15度左右，从高于熔解温度几度到低于它10度，除此之外，其他的基本要求与常规PCR一致。 差异显示PCR（DD-PCR） 差异显示PCR通过比较不同细胞类型或不同生长条件的同种细胞类型来源的扩增cDNA产物电泳带谱，鉴定其表达基因图谱的差异。其基本步骤与RT-PCR相似，首先用一套锚定引物（多是与mRNA的poly（A）尾和转录序列最后2个核苷酸互补的序列组成）将RNA反转录为cDNA，然后用一套通常10mer长的随机引物和锚定引物一起对cDNA进行扩增，电泳后进行带谱比较，而且特异的条带可从胶上切下来，进一步扩增克隆以作为探针用于cDNA文库筛选和Northern杂交分析等。 多重PCR(Multiplex-PCR ) 多重PCR(multiple PC