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第四章 蛋白质的分离纯化 1。材料的预处理和蛋白质的抽提 2。分离和纯化 一、蛋白质分离纯化的一般程序 （一）材料的预处理及细胞破碎 分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。 1. 机械破碎法 ——利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。 2. 渗透破碎法 ——在低渗条件使细胞溶胀而破碎。 3. 反复冻融法 生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。该法简单方便，但对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。 4. 超声波法 使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。 5. 酶法 如用溶菌酶破坏微生物细胞等。 (二) 蛋白质的抽提 通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等应根据性质而定。 如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（SDS、tritonX-100等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。 在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。 分段盐析： 半饱和硫酸铵溶液可沉淀分子量较大的血浆球蛋白，而饱和硫酸铵溶液可沉淀分子量较小的血浆清蛋白。 因此，使用不同浓度的硫酸铵溶液就可将分子量不同的蛋白质进行初步分离。 2. 有机溶剂沉淀蛋白质： 凡能与水以任意比例混合的有机溶剂，如乙醇、甲醇、丙酮等，均可用于沉淀蛋白质。 沉淀原理是：① 脱水作用；② 使水的介电常数降低，蛋白质溶解度降低。 （二）电泳技术 （electrophoresis) 1.定义： ——带电离子在电场中的移动称为电泳。 在外电场的作用下，带电蛋白质颗粒将向旨与其电性相反的电极移动。 电泳技术是分离不同分子混合物的常用实验技术。可用于氨基酸、肽、蛋白质、核苷酸和核酸等生物分子的分离分析和制备。 影响蛋白质的泳动速度的因素： 内因——蛋白质净电荷量、颗粒的大小和形状。 外因——溶液的pH值、离子强度、电场强度、 温度等也会影响蛋白颗粒的泳动速度。 不同蛋白质的等电点分子大小和形状不同，在同一pH时带电荷数不等，因而其在同一电泳条件下的泳动速度不同因而可被分开。 若将带静电荷Q的离子置于电场中，它的受力简单分析如下： 电荷引力： F引＝EQ 根据Stokes公式，运动中的颗粒在溶液中受到阻力： F阻＝6π r η ν 平衡时，有 F引＝F阻，即 EQ＝6 π r η ν 整理后得： ν＝EQ/（6π r η） 式中：E——电场强度； r——球形粒子的半径； η——溶液的粘度系数； ν——带电粒子运动速度。 2. 电泳分类 按照电泳时是否使用支持介质，可将电泳分为： 界面电泳——在溶液中进行 如右图→→ 区带电泳——借助于固体支持物 区带电泳按其支持介质的物理性状不同可以分成： 滤纸电泳－在滤纸电泳； 薄膜电泳－如醋酸纤维薄膜电泳和聚酰胺薄膜电泳； 粉末电泳－支持介质是淀粉、纤维素粉或硅胶粉等，粉末与适当的溶剂调和铺设成平板； 细丝电泳－如尼龙丝和其它人造丝电泳，这是—类微量电泳； 凝胶电泳－最常用的介质有聚丙烯酰胺凝胶（分离蛋白质）和琼脂糖凝胶（分离核酸）。这两种凝胶电泳的分辨率都很高。 按支持物的装置形式不同，区带电泳可分为： 1) 平板式电泳，支持物水平放置，是最常用的电泳方式； 2) 垂直板式电泳，聚丙烯酰胺凝胶常做成垂直板式电泳； 3) 垂直柱式电泳，聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳即属于此类； 4) 连续液动电泳，首先应用于纸电泳，将滤纸垂直竖立，两边各放一电极，溶液自顶端向下流，与电泳方向垂直。后来有用淀粉、纤维素粉、玻璃粉等代替滤纸来分离血 清蛋白质，分离量最大。 凝胶电泳－最常用的介质有： （1） 聚丙烯酰胺凝胶（分离蛋白质） （2） 琼脂糖凝胶（分离核酸）。 这两种凝胶电泳的分辨率都很高。 另有：琼脂、硅胶、淀粉胶等 聚丙烯酰胺凝胶是分离蛋白质时最常用的凝胶，可以制作成平板或柱子（图）。故又称为平板凝胶电泳和柱状凝胶。 3. SDS① SDS-蛋白质形成复合物，1.4克SDS与1克蛋白质结合，相当于每两个氨基酸残基结合一个分子的SDS。这样，蛋白质的原有电荷效应被覆盖，带有相同密度负电荷，分子量大小与迁移率成正比。 ② SDS改变蛋白质分子单体构象，全部变成似雪茄烟形的长椭圆棒型。