高丽参水溶性多糖GPⅢ的分离纯化及组成研究.docVIP

　　高丽参水溶性多糖GPⅢ的分离纯化及组成研究 【摘要】 目的：从高丽参中提取出水溶性粗多糖GP，经分离纯化，得到均一多糖GPⅢ，研究其组成等性质。方法:粗多糖经Sevage法脱蛋白，DEAE Sepharose CL6B柱层析分离纯化得到GPⅢ，经HPLC和醋酸纤维素薄膜电泳法检验其均一性。结果：GPⅢ是均一组分多糖，GC分析它的单糖组成是葡萄糖。结论：GPⅢ是均一组分多糖，GC分析单糖组成是葡萄糖，方法准确。 【关键词】 高丽参 分离 纯化 组成 　　高丽参为五加科植物人参Panax ginseng C. A. Mey的干燥根。主产于我国东北地区,朝鲜和日本，俗称别直参［1］。本文对高丽参粗多糖进行分离纯化，并对它的组成成分等性质进行了研究。 　　1 材料、试剂与仪器 　　1. 1 材料 高丽参:购于辽宁丹东。 　　1. 2 试剂与仪器 单糖标准品为Sigma公司试剂；DEAEsepharose CL6B凝胶为Pharmacia公司产品；其他试剂均为上海化学试剂有限公司分析纯。MC992自动核酸蛋白分离层析仪，上海沪西分析仪器厂；高效液相色谱，安捷伦HP1100；气相色谱仪，安捷伦6890N。 　　2 实验方法 　　2. 1 高丽参粗多糖的提取 准确称取高丽参250 g，加入一定体积80%乙醇，在50℃水浴中回流提取6 h，离心得提取液。残渣烘干后，取50 g加入3000 mL的蒸馏水，在80℃恒温水浴下提取2 h，过滤，滤液在60℃下减压旋转蒸发浓缩，离心，上清液加入4倍体积无水乙醇进行醇沉，放置4℃冰箱中过夜。次日离心10 min(3000 r/min)，取沉淀，常规干燥得粗多糖GP。 　　2. 2 粗多糖的分离与纯化［23］ 　　2. 2. 1 脱蛋白 3%糖溶液，按木瓜蛋白酶：蛋白质1：50取蛋白酶，加入糖溶液中，将糖液装入透析袋，37℃，保温24 h，加少量二甲苯防腐。按糖液总体积1/4加入Sevage试剂(氯仿:正丁醇＝4:1)，充分振荡2～3 h，静止，离心，取上清重复，至无游离蛋白为止。 　　2. 2. 2 粗多糖的DEAESepharose CL6B柱层析制备 500 mg经脱蛋白后得GP溶于10 mL蒸馏水,先后用蒸馏水和01M NaCl进行洗脱，流速调为40 mL/h，1管/12 min，自动部分收集器收集。用苯酚硫酸法测定糖的分布情况，按各个波峰范围部分收集洗脱液，由分离层析仪中的UV160A紫外光谱于280 nm下同步检测蛋白质。 　　2. 3 多糖样品纯度鉴定方法［4］ 多糖样品的纯度鉴定采用高效液相色谱法和醋酸纤维素薄膜电泳法。高效液相色谱柱为SUGAR KS804，水作流动相，流速1 mL/min，柱温50℃，示差检测器检测。 　　2. 4 红外光谱分析 取2 mg糖样，KBr亚片，红外光谱分析。 　　2. 5 糖组成分析［46］ 10 mg的糖样溶于10 mL 2M三氟乙酸120℃水解6 h，水解产物用无水乙醇蒸除三氟乙酸至中性，干燥产物进行衍生物的制备(硅烷化)。气相色谱柱是HP5毛细管柱(30 m×0. 32 mm,0. 25 μm)，柱温采用程序升温即160℃ 20℃/ min 180℃ 10℃/min 220℃(2 min)，检测器和进样口温度均是230℃。 　　2. 6 分子量测定［4］ 取标准样品(T10、T40、T70、T500、蓝色葡聚糖、葡萄糖)及待测样品溶于去离子水中，用0. 4 μ纤维素膜过滤，进样，测出各自的保留时间。根据各标准品的保留时间,按公式Kav(VeVo)/(VtVo)求出对应的Kav, 以LogM. 　　3 结果与分析 　　3. 1 粗多糖的提取与分离纯化 高丽参经水提取,粗多糖GP得率为28. 05%。GP经脱蛋白后，上DEAESepharose CL6B柱层析制备，按01M NaCl制定洗脱曲线，GP的NaCl梯度洗脱液经苯酚硫酸检测只含有一个糖洗脱峰，紫外检测仪在280nm下也检测到1个蛋白质洗脱峰，并且与糖洗脱曲线相吻合，推测此糖组分可能含有结合蛋白质，收集42～60管洗脱液，透析，浓缩，醇沉，沉淀常规干燥命名为GPⅢ。 　　3. 2 GPⅢ的纯度鉴定 配制0. 1%的样品液，0. 4 μ纤维素膜过滤，进样量20 μL。GPⅢ的高效液相色谱结果检测出一条峰，证明GPⅢ是纯度较好的样品。GPⅢ在醋酸纤维素薄膜电泳上也跑出来一条区带，再次验证GPⅢ为成分单一的一种多糖。 　　3. 3 GPⅢ的分子量鉴定 GPⅢ的保留时间分别是6. 085,查标准曲线，得GPⅢ的分子量分别在40万左右。 　　3. 4 GPⅢ的性质分析 红外光谱分析表明，GPⅢ在3 600～3 200 cm有