高免疫原性胶质瘤细胞疫苗体外抗瘤时靶细胞超微结构变化.docVIP

　　高免疫原性胶质瘤细胞疫苗体外抗瘤时靶细胞超微结构变化 作者：郑树法, 康德智, 林元相, 连葆强 【摘要】 目的 观察高免疫原性人多形性胶质母细胞瘤（GBM）U251细胞疫苗体外诱发产生效应细胞杀伤靶细胞的超微结构变化。 方法 以500 U/mL干扰素γ(IFNγ)诱导48 h+热43℃休克2 h诱导膜型热休克蛋白70(HSP70)及主要组织相容性抗原复合体I类分子（MHCI）双高表达，经丝裂霉素(MMC)灭活制成高免疫原性细胞疫苗。体外刺激健康捐献者外周血单个核细胞（PBMCs）作为效应细胞（MHCHSPCTL），进行肿瘤特异性杀伤试验；MTT比色法检测其杀伤活性；透射电镜观察靶细胞受攻击后情况。 结果 MHCHSPCTL对野生型U251细胞特异性的杀瘤活性明显高于HSP70分子单高表达的细胞疫苗刺激组（HSPCTL）、MHCI类分子单高表达的细胞疫苗刺激组（MHCCTL）以及野生型对照组（HCI类分子双高表达疫苗的U251细胞疫苗一种重要主动特异性抗瘤机制。 【关键词】 基因, MHCⅠ类； 干扰素Ⅱ型； 热休克蛋白质70； 神经胶质瘤； 细胞系, 肿瘤； 癌症疫苗； 免疫疗法； 显微镜检查, 电子 热休克蛋白70(heat shock protEin 70，HSP70)与主要组织相容性抗原复合体I类分子(major histopatibility plex class I，MHCI)是参与抗原呈递两种重要的分子。近年来研究发现HSP参与机体特异的抗瘤免疫反应[1]，HSP表达量的多少与肿瘤免疫原性的强弱密切相关[2]；MHCI表达的增加，与MHC结合并提呈在肿瘤细胞胞上的胶质瘤特异性抗原或胶质瘤相关性抗原量亦随之增加，胶质瘤的免疫原性可随其MHC表达量的增加而增加[3]。笔者先前研究证实了HSP70和MHCI类分子双高表达人多形性胶质母细胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）U251细胞疫苗具有高免疫原性[4]。本研究观察该类高免疫原胶质瘤细胞疫苗诱发产生效应细胞杀伤靶细胞时的超微结构变化。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1 材料 人多形胶质母细胞瘤细胞U251细胞（中科院上海生命 科学 研究所）；SGC7901胃癌细胞株（福建医科大学药理研究室）；RPMI1640（美国Gibcorl公司）；小牛血清（美国Hyclone公司）；含5%EDTA Typsin(美国Gibcorl公司); 3（4，5二甲基2噻唑）2，5二苯基溴化四唑（MTT，上海生物工程公司)；丝裂霉素（日本KyoL干扰素γ(interferongamma，IFNγ)诱导48 h组；热43 ℃休克2 h组；先500 U/mL IFNγ诱导48 h+后热43 ℃休克2 h共3个诱导组。单因素热43 ℃休克2 h诱导组和双因素先500 U/mL IFNγ诱导48 h+后热43 ℃休克2 h后，立即放回37 ℃孵箱恢复2 h收集细胞。分别取上述3组细胞及未经任何刺激的处于对数生长期野生型U251细胞单细胞悬液（野生型对照组），于0.2 mg/mL的丝裂霉素（MMC）灭活2 h。0.4%胎盼蓝染色检测灭活后U251细胞存活率；取健康捐献者外周血50 mL以淋巴细胞分离液常规分离外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMCs），计数，调整细胞浓度为5×106 mL-1备用；将PBMCs与3种人脑胶质瘤细胞疫苗按5∶1的比例共孵以诱导产生3种不同效应细胞，即MHCCTL（MHCI类分子单高表达U251细胞，经灭活制成的细胞疫苗，体外刺激PBMCs形成的效应细胞）、HSPCTL（膜型HSP70分子单高表达U251细胞，经灭活制成的细胞疫苗，体外刺激PBMCs形成的效应细胞）、MHCHSPCTL（膜型HSP70及MHCI双高表达的U251细胞，经灭活制成高免疫原性细胞疫苗，体外刺激PBMCs形成的效应细胞）及Cs形成的效应细胞），7 d后以密度梯度离心法去除瘤苗获得效应细胞。 1.2.2 MTT比色法检测效应细胞体外特异性杀伤活性 将上述4种效应细胞分为4组即MHCCTL组、HSPCTL组、MHCHSPCTL组及I1640培养液，每个处理孔设3个复孔，其中靶细胞浓度为1×105mL-1效应细胞浓度为1×106 mL-1。培养培养24 h后加入MTT液37 ℃孵育4 h，弃上清，加入DMSO充分振荡，于96孔酶标仪上490 nm波长测其D值。靶细胞为U251野生型[ol/L PBS (pH7.2)4 ℃固定数天或数小时；1%锇酸1.5%亚铁氰化钾后固定1.5 h；PBS漂洗；70%酒精