N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶的化学修饰.pdfVIP

1 N- 乙酰鸟氨酸脱酰基酶的化学修饰 * 翁秋萍，陆高圣，李环 ，韦萍 南京工业大学制药与生命科学学院，南京（210009 ） E-mail ：wqp8731650@126.com 摘 要：采用PMSF、NBS 、DTNB 、DEPC 、WRK 五种化学试剂，选择性修饰N- 乙酰鸟氨 酸脱酰基酶中丝氨酸的羟基、色氨酸的吲哚基、半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基、天冬氨 酸和谷氨酸的羧基，研究氨基酸侧链基团与酶活性中心的关系。结果显示，以DEPC 、WRK 修饰后，酶的活力明显下降，而PMSF、NBS 、DTNB 对酶的活力影响不大，说明组氨酸和 酸性氨基酸可能为酶活性中心的必需氨基酸，而丝氨酸残基、色氨酸残基、半胱氨酸残基不 参与酶活性中心的形成。底物N- 乙酰-D,L-蛋氨酸对酶有较好的保护作用，保护作用随浓度 增加而增加。 关键词：N- 乙酰鸟氨酸脱酰基酶，活性中心，化学修饰，底物保护 中图分类号：Q556 文献标识码：Ａ 大肠杆菌中 argE 编码的 N- 乙酰鸟氨酸脱酰基酶（N-acetylornithine deacetylase, 简称 NAOase ；EC6 ）催化N- 乙酰鸟氨酸脱去乙酰基，生成 L-鸟氨酸。该反应是精氨酸合 成关键的一步[1-2] [2] [7] 。NAOase 可应用于氨基酸立体拆分 、农林除草 方面，同时也具有潜在 的医药应用价值[1,5,7] 。因此对 N- 乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶的研究具有重要的理论研究意义及 生产价值。目前国内外对该酶的研究较少，国外对此酶的作用机理、底物特异性、基因序列、 对金属离子对其影响等方面方面有了一定的研究[1-6] ，国内主要研究了该酶的高效表达、纯 化和复性，及其发酵培养基的优化等方面[7～9] ，而对该酶的具体催化机制、酶的构象、活性 中心组成、底物和酶的结合位点、三维结构等基础性研究尚未见报道[3-6] 。 蛋白质的化学修饰是研究酶的活性中心和探清酶必需基团组成的一个有效方法，也是研 究蛋白质结构与功能的重要手段，对于空间结构未知的蛋白质分子尤为重要。对蛋白质侧链 基团进行化学修饰，可以探明酶活性部位的结构[11] 。利用化学修饰的方法来探讨酶活性中 心已成为一种较为经典的方法[12-15] 。 运用生物信息学软件预测出该酶的活性部位有两个金属离子结合位点，7 个酪蛋白激酶 II(CKII)磷酸化位点，2 个蛋白激酶 C 磷酸化位点、5 个 N 末端十四烷基化位点, 无糖基化位 点，而且活性中心可能含有组氨酸残基、谷氨酸残基、天冬氨酸残基。本文以 SDS 电泳纯的 N- 乙酰鸟氨酸脱酰基酶为研究对象，对其进行化学修饰研究，分析其活性中心可 能的氨基酸残基，确定相应基团在活性中心中的作用，以期为 N- 乙酰鸟氨酸脱酰基酶结构 与功能之间的关系奠定了一定的研究基础。 1 材料与方法 1.1 主要材料 菌种：基因工程菌 BL21-pET22b(+)-argE ，为南京工业大学制药与生命科学学院国家重 点实验室构建。 主 要 试 剂 ： NBS(N-bromosuccinimide), DTNB (5,5-dithio-bis-(2-ni-tr obenzonic-acid) ， PMSF(phenylmethyl-sulfonyl-fluoride), WRK (N-ethyl-5-phenylisoxa-zolium-3-sulfo- 1本课题得到国家 973 课题资助项目（NO.2003CB7160004 ）的资助。 *通讯作者。 - 1 -