RGD-葡激酶的凝胶过滤层析法复性及其纯化.pdfVIP

卷 期 生 物 工 程 学 报 ! # ’( ) ! *’ )# 年 月 $%%$ !! !#$%% ’()*$+, (- .#(/%0$(,(12 *’+,-.,/ $%%$ !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! !#$葡激酶的凝胶过滤层析法复性及其纯化 程 鏖 宋 刚 苏华波 于 敏 李育阳 宋后燕 （复旦大学教育部分子医学重点实验室 上海 $%%%2$；复旦大学生命科学院 上海 $%%122 ） 摘 要 构建的溶栓和抗栓双重功能的 葡激酶突变体（ ）在大肠杆菌中高表达，目的蛋白质以包涵体 FGH0 FGH0I9J 形式存在。为获得有活性的蛋白质，需要对包涵体进行变复性。利用凝胶层析方法对包涵体中FGH0I9J 进行复 性，并与稀释复性法进行比较，发现凝胶柱复性方法具有操作周期短、简便、成本低而高效等优点。复性后蛋白质 用K0I,L=9/’?, 88 离子交换进一步纯化，纯度达54 M ，酪蛋白凝胶板活性测定表明两种复性法得到的蛋白质比活性 相当。圆二色谱测定显示两种复性法得到的蛋白质的二级结构成份和谱形一致，说明在两种复性过程中完成了 FGH0I9J 分子的正确折叠。 关键词 葡激酶，包涵体，复性，圆二色谱（ 谱） FGH0 NH 中图分类号 文献标识码 文章编号 （ ） K7! 3 !%%%02%#! $%%$ %#0%#520%4 葡激酶（ ， ）是一种由金黄色葡 等将 融合序列连接在 的 末 IO9L=(’J@9?, I9J S9(D9 FGH I9J N ［］ 萄球菌中几种溶源性噬菌体分泌的蛋白质，其成熟 端4 ，但溶栓活性大大削弱，而我们的FGH0I9J 保持 蛋白质由!2# 个氨基酸组成，相对分子量为 !4%%% 。 了与野生型相仿的催化效率，并在 3 ) 0(,# 中得到高 是一种纤溶酶原（ ， ）的激活因子， 效表达，表达量占菌体总蛋白量的4% M ，但重组 I9J P(9?-@’A,@ P(A 在血浆中与P(A 形成 ! Q ! 复合物，该复合物被血块 FGH0I9J 在大肠杆菌中以包涵体形式存在，虽易于 表面痕量纤溶酶（ ， ）激活为 ， 纯化，但复性工作是获得活性蛋白质的难点和重点。 P(9?-@ P(- I9J0P(- I9J0 P(- 是高效纤溶酶原激活剂，特异切割 形成有活 影响蛋白质复性的因素主要与氨基酸序列，二 P(A 性的P(-，溶解血栓，其溶解血栓特异性强，对富含 硫键，分子的空间结构，亲疏水特性等有关；此外还 血小板的血栓溶解效果较其他溶栓药好。 受蛋白质浓度、纯度、变性剂浓度、复性液离子强度、 我们的FGH0葡激酶，是在重组葡激酶的合适部 LT 值等影响。传统的稀释复性方法虽比较通用，但 位通过定点突变（ ， ）引进