实验三尿蛋白的定量测定.ppt-陕西师范大学.ppt

运动生物化学实验课件 陕西师范大学运动与健康实验教学示范中心 实验三 尿蛋白的定量测定 （双缩脲法） 学习尿蛋白的测定方法 加深对尿蛋白的认识及其测试的意义 掌握尿蛋白指标在运动训练中的应用 一、 实验目的 蛋白质分子中含有许多肽键，在碱性溶液中能与Cu2+作用产生紫红色络合物，与双缩脲分子结构相似，故称双缩脲反应。 其紫红色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，可用比色法测定其含量。 二、实验原理 三、试剂 15N硫酸溶液。 1.5%钨酸钠溶液 双缩脲试剂 用一次性尿杯留取尿液（如测24h尿蛋白，则需将24h尿液混匀后留样）。用pH试纸测试尿液酸碱度，若pH超过8.0，用少量30%乙酸调节至中性偏酸，用尿蛋白试纸做定性测试，若尿蛋白在 “+++”至“++++”之间，则需将尿液稀释5倍。 取1支大离心管，标号，按表1操： 四、实验操作 离心管 尿液或稀释尿液（ml） 5%硫酸溶液（ml） 1.5 钨酸钠溶液（ml） 5.0 2.5 2.5 充分混匀后，静置10分钟，离心5分钟(3000转/分) ，倾去上清液,将试管倒置沥干，保留沉淀 表1 尿蛋白的提取 另取6支大试管，分别作为空白管及标准管1~5，上述含沉淀物的离心管为测定管，标号后按表2操作： 四、实验操作 空白管 标准管 测定管 1 2 3 4 5 生理盐水 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 — 1.0 标准蛋白液 — 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 — 双缩脲试剂 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 充分混匀后，置37 ℃水浴15分钟，以空白管调零， 540nm比色 表2 尿蛋白定量测定 计算公式： （1）标准管法 尿蛋白（mg%）= OD测/OD标×Cs ×尿液稀释倍数 （2）绘制标准曲线，查出测定管结果。 五、实验结果 尿液较浑浊时，应先加热清除无机盐结晶。 六、注意事项 正常成年人尿中蛋白质含量很少，其浓度在10mg%以下，日排出总量不超过150mg。运动员安静状态下尿蛋白质含量与一般人没有差异。 尿蛋白排出量随强度的增大而增加。 采样时间：运动后15分钟，因为这时尿蛋白达最高值，20分钟尿蛋白开始下降，4小时内基本恢复，时间延长说明机能下降。 结果大于零而小于10mg%，说明生理条件正常，或运动量合适。 测定结果大于10mg%，分析近期运动强度和负荷量的情况 七、指标应用 结果为零可能有如下因素：离心之后不小心将蛋白质沉淀倒掉；操作过程中没有及时摇匀，蛋白质沉淀没有溶解；加入生理盐水等过多，将蛋白质稀释；加钨酸钠溶液后静置时间不够，蛋白质没有充分沉淀下来；加双缩脲试剂后放置时间太短，反应没有完全进行。 结果过高，或出现混浊，可能是尿液中磷酸盐、草酸盐等过多，在尿液呈酸性或碱性时结晶析出。 运动生物化学实验课件 陕西师范大学运动与健康实验教学示范中心