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剖析蛋白免疫印迹半定量在药理学研究中的影响 　　蛋白免疫印迹( Western blot) 是当前蛋白分析的一种常规技术，它结合了电泳的高分辨率和酶免疫测定的高敏感性和特异性，用于检测样品中特异蛋白存在与否、细胞中特异蛋白的半定量分析和蛋白质分子相互作用的研究。在药理学研究中，使用蛋白免疫印迹分析通常都是为了半定量检测某种目的蛋白的相对表达量，常采用灰度分析软件检测目的蛋白及内参条带的表达强度，以分析药物等处理因素对目的蛋白的影响。但由于该检测方法步骤较繁琐，实验变量较多，结果不稳定等特性，使得应用该法测定组织中的目的蛋白浓度时常常会遇到困难，需花费大量的人力物力财力和时间去摸索实验条件。虽然各种教科书和网络上都有讨论如何做好蛋白免疫印迹分析，并提出各种注意事项，但作为药理学工作者，仅有这些常识仍不能很好完成药理学评价，甚至做出相反的实验结果。本实验从实验实践分析出发，讨论蛋白免疫印迹半定量分析在药理学研究中的影响因素及处理方法，为广大药理学工作者提供参考。 　　1 实验材料 　　1. 1 细胞丙型肝炎 　　病毒( HCV) 感染的人肝传代细胞系Huh7. 5 细胞，用0. 05%-EDTA 胰酶消化传代，用含10%灭活胎牛血清及每毫升100 单位青霉素和100 单位链霉素的DMEM 培养基正常传代和富集培养。 　　1. 2 主要生化试剂 　　DMEM、胎牛血清( 美国GiBco 公司) ; 细胞总蛋白提取试剂CytobusterTM Protein Extraction Reagent( 美国Novagen 公司) ; 蛋白酶抑制剂Complete proteaseinhibitor cocktail tables( 德国Roche Applied Science公司) ; Penicillin-Streptomycin 双抗、PBS、0. 05%-EDTA 胰酶均( 中科迈晨科技有限公司) ;5 times; Loading Buffer ( Lane Marker Sample Buffers ) 、PageRulerTM Prestained Protein ladder、PierceTM BCAProtein Assay Kit( Thermo Scientific 公司; 30% 丙烯酰胺溶液、1. 5 mol·L - 1 Tris-Cl ( pH 8. 8) 、1 mol·L - 1 Tris-Cl ( pH 6. 8) 、10% SDS 溶液、TEMED、过硫酸铵、三羟基氨基甲烷Tris 碱、甘氨酸、十二烷基硫酸钠SDS( 北京普利莱基因技术有限公司) ; 聚山梨酯20( 西陇化工股份有限公司) 。无水乙醇、浓盐酸、NaCl、甲醇、异丙醇等均为分析纯; PVDF 膜和化学发光液ImmobilonTM Western ChemiluminescentHRP Substrate ( 美国Millipore 公司) 。 　　1. 3 抗体 　　抗HCV Core 蛋白小鼠单抗( C7-50，ab2740 )( 英国Abcam 公司) ; 小鼠抗Gapdh 和小鼠抗Tubulin单抗( 中杉金桥生物技术公司) ; 抗小鼠IgGHRP-linked ( Cell Signaling 公司) 。 　　1. 4 主要仪器 　　Mini-Ⅲ型电泳系统、Bio-Rad 湿转系统和凝胶成像系统( PowerPac 200、ChemiDocTM XRS + ) 均为美国BIO-RAD 公司。 　　2 实验方法 　　2. 1 实验步骤 　　2. 1. 1 细胞总蛋白的制备将3 瓶T75培养瓶内HCV 感染的Huh7. 5 细胞用胰酶消化后，分别用6ml DMEM 吹散后收集并以1 000 times; g 离心5 min，弃上清，细胞用600 mu;L 蛋白裂解液裂解45 min ( 冰浴) 后在4 ℃条件下12 000 times; g 离心20 min，上清吸出混匀后分装，每管100 mu;L，取一管用于蛋白定量，其他分别加25 mu;L 5 times; Loading Buffer 煮沸10 min，- 20 ℃保存等测。 　　2. 1. 2 蛋白免疫印迹分析操作步骤常规方法配置5% 积层胶和10% 分离胶，胶厚1. 0 mm。上样后，恒压电泳( 冰浴条件) ，积层胶55 V 40 min，分离胶115 V 60 min。以240 mA 转膜60 min ( 冰浴) ，在摇床上用5% 脱脂牛奶封闭60 min。用3% 脱脂牛奶将一抗稀释到相应浓度和体积，并根据实验要求孵育相应时间。一抗孵育后将膜用1 times; T