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分析b 型流感嗜血杆菌荚膜多糖分子量的方法的验证 　　b型流感嗜血杆菌荚膜多糖-核糖基核糖醇磷酸盐(polyribosyl ribitol phosphate，PRP)，其重复单位是由核糖醇、核糖、磷酸盐连接而成。多糖重复单位中，核糖通过C1 位的羟基与核糖醇C1 位羟基位置相连，核糖醇C5 位的羟基则与磷酸形成酯键，而磷酸另一侧则与核糖C3 位羟基连接。应用较多的测定PRP 分子量的方法为分子大小排阻层析法，是以一系列已知分子量的葡聚糖在该层析柱上对洗脱体积或时间作校正曲线，将待测样品的洗脱体积或时间代入曲线方程后，即可算得该样品的分子量。近年来，高压液相分子排阻层析-十八角激光散射仪(high performance size exclusion chromatography-Multiangle laser-light scattering，HPSEC-MALLS)联用法以快速、高效、稳定等特点被WHO推荐纳入多糖质控体系。默沙东公司、巴斯德公司研究人员使用高效液相排阻层析与多角度激光光散射仪、示差检测器联用技术(high performance size exclusion chromatography-Multiangle laser light scattering-Refractive index，HPSEC-MALLS-RI)分别对b 型流感嗜血杆菌荚膜多糖、上市的23价肺炎球菌多糖疫苗PNEUMOVAX誖23(纽莫法)中包括的各血清型荚膜多糖分子量进行了测定。本研究参照美国FDA生物分析方法验证指南，对HPSEC-MALLS 方法的准确性和精密度进行验证，再用该方法对15 批兰州生物制品研究所有限责任公司生产并检定合格的b 型流感嗜血杆菌荚膜多糖的分子量及其分布进行检测，并初步分析其与传统的分子大小指标分配系数(KD)的相关性，以期为多糖及结合疫苗质量控制方法的优化提供参考。 　　1 材料与方法 　　1. 1 多糖、类毒素及蛋白 　　15 批b 型流感嗜血杆菌荚膜多糖和破伤风类毒素[tetanus toxoid，TT，重均分子量(weight-average molecular weight，Mw)为157 799 g /mol]均由兰州生物制品研究所有限责任公司生产并检定合格;牛血清白蛋白(bovine serumalbumin，BSA)购自美国Sigma-Aldrich 公司，Mw 为66 352 g /mol。TT 与BSA 的Mw 均经基质辅助激光解析串联飞行时间质谱测得。 　　1. 2 主要试剂及仪器 　　普鲁兰多糖分子量标准品盒Shodex STANDARD P-82[内含标准品P-20(Mw：2. 28 times;104 g /mol)、P-200(Mw：21. 2 times;104 g /mol)、P-400(Mw：40. 4 times;104 g /mol)、P-800(Mw：78. 8 times;104 g /mol)]购自日本Shodex 公司;氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠均购自国药集团化学试剂有限公司;高压液相色谱仪购自美国Waters 公司;DAWNHELEOS-域十八角激光散射仪、Optilab T-rEX 示差检测器均购自美国Wyatt 公司;TSK 层析柱及其保护柱均购自日本TOSOH公司。 　　1. 3 方法的验证 　　1. 3. 1 准确性验证分别称取普鲁兰多糖标准品P-20、P-200、P-400、P-800各5. 0 mg，用流动相(pH 7. 0的0. 01 mol /L磷酸盐缓冲液)溶解至2. 0 mg /ml。待溶解完全后，经0. 22 mu;m 滤膜过滤至样品瓶中。TSK 层析柱用0. 01 mol /L 磷酸盐缓冲液平衡后，依次上样100 mu;l，流速0. 5 ml /min，每个样品运行时间40 min，使用ASTRA5. 3. 4 软件进行记录，分析处理，计算Mw、分布情况[多聚分散度= Mw /数均分子量(number average molecular weight，Mn)]及相对偏差，每个样品平行测定3次。将TT和BSA分别用流动相(pH7.0的0.01mol/L磷酸盐缓冲液)稀释至1. 0 mg /ml，经0. 22 mu;m滤膜过滤至样品瓶中。检测Mw及其分布情况，方法同上。 　　1. 3. 2 精密度验证分别称取普鲁兰多糖分子量标准品P-20、P-200、P-400、P-800 各5. 0 mg，用流动相(pH 7. 0的0. 01 mol /L 磷酸盐缓冲液)溶解至2. 0 mg /ml。溶解完全后，0. 22 mu;m滤膜过滤至样品瓶中。按照1. 3. 1项