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剖析肺炎链球菌临床分离株喹诺酮耐药的相关性研究 　　肺炎链球菌是我国社区获得性肺炎的最常见病原体，近10 年肺炎链球菌对青霉素类和大环内酯类抗菌药物的耐药率的上升，使喹诺酮类抗菌药物成为治疗社区获得性肺炎的推荐用药。喹诺酮类是一类全合成的抗菌药物，具有抗菌谱广、抗菌力强、作用机制独特、高效、低毒等特点。目前肺炎链球菌临床分离株对喹诺酮类药物的耐药率在全球的大部分地区仍较低，但近年国内外都相继出现耐喹诺酮类肺炎链球菌临床菌株、且耐药率有上升的趋势。体外研究证实酿脓链球菌和猪链球菌在喹诺酮类药物的持续选择压力下，可以诱导菌株的parC /parE 和gyrA /gyrB 基因的喹诺酮耐药决定区(quinolone resistancedetermining regions，QRDR) 点突变，并伴随体外最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)的上升产生对喹诺酮类耐药。为了解肺炎链球菌对喹诺酮类药物的耐药机制，收集了37 株肺炎链球菌临床菌株并检测了其对8 种抗生素的耐药性，PCR扩增所有菌株parC /parE 和gyrA /gyrB 基因包括QRDR 在内的核苷酸序列并直接测序，分析对左氧氟沙星MICle;1 mg /L 和MIC = 2 mg /L 菌株目的基因QRDR 突变情况。 　　1 材料与方法 　　1. 1 菌株 　　37 株肺炎链球菌临床菌株2011 年-2013 年分离自浙江省人民医院康复中心病人临床标本并经系统的细菌学鉴定。药敏试验质控菌株肺炎链球菌ATCC49619 购自卫生部临检中心，金黄色葡萄球菌ATCC25923 和大肠埃希菌ATCC25922 由浙江大学医学院病原生物学系提供。肺炎链球菌接种于含5%脱纤维羊血的MH 琼脂平板上，37 ℃、5% CO2条件下培养。金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌接种于MH 琼脂平板上37 ℃培养。 　　1. 2 试剂 　　青霉素G( 批号:121011) 购自美国Amresco公司，阿莫西林(批号:1148977)、红霉素(批号:140211)、左氧氟沙星( 批号:140226)、莫西沙星( 批号:140233)和万古霉素(批号:140215)均购自杭州天和微生物试剂有限公司，阿奇霉素( 批号:140317) 购自华北制药集团沈阳第一制药有限公司，克林霉素(批号:513116112)购自山东罗欣药业股份有限公司。MH 肉汤(批号:1181677)和MH 琼脂(批号:992952)购自英国Oxoid 公司。细菌基因组DNA 提取试剂盒(批号:0418) 购自上海博彩生物科技有限公司(Bio-Color)。PCR 试剂盒、PCR 产物纯化试剂盒( 批号购自大连宝生物有限公司(TaKaRa)。 　　1. 3 方法 　　1. 3. 1 药敏试验采用NCCLS 推荐的二倍微量稀释法，检测37 株肺炎链球菌临床菌株对8 类抗生素的最低抑菌浓度。收集各菌株新鲜培养物，配制成浊度为0. 5 麦氏管的菌液。用5%溶血羊血MH 肉汤为药敏培养基，内含经二倍稀释不同浓度的抗生素，细菌接种量为1 times; 105 /ml，35 ℃培养24 h，如果有浑浊或血液变成棕色为生长。实验中分别采用肺炎链球菌ATCC49619、金黄色葡萄球菌ATCC25923 和大肠埃希菌ATCC25922 株作为质控菌株。 　　1. 3. 2 细菌基因组DNA 模板制备将新鲜细菌培养物3 000 r /min 离心，取沉淀的菌体用0. 01 mol /L、pH 7. 4 的磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤、离心3 次后取沉淀。参照细菌基因组DNA 提取试剂盒说明书，提取各菌株基因组DNA。提取的DNA 溶于Tris - HCl -EDTA(TE)缓冲液中，采用紫外分光光度法测定DNA浓度和纯度。 　　1. 3. 3 PCR 引物设计参考Genbank 已报道的肺炎链球菌parC /parE 基因( accession no. :AAK99560 和Z67739) 和gyrA /gyrB 基因( accession no. :AF053121和Z67740)序列。委托上海Invitrogen 公司合成引物。PCR 总体积为100 mu;l，内含2. 5 mol /L各dNTP、250 nmol /L 各引物、2. 5 U Ex - Taq DNA 聚合酶(TaKaRa)、5 mu;l DNA 提取物为模板、1 times; PCR 缓冲液(pH 8. 3)。PCR 参数:94 ℃ 4 min;94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35 个循环;72 ℃ 5 mi