剖析ＧＰＣＲｓ二聚的功能和药理作用展望.docVIP

剖析ＧＰＣＲｓ二聚的功能和药理作用展望 　　G 蛋白偶联受体(G　protein　coupled　receptors，GPCRs)具有7次跨膜结构，家族成员有800～1000多个，其相关药物占上市药物的40%～50%，因此，GPCRs是重要的药物靶点之一。最初认为GPCRs是以单体的形式存在的，并以单体的形式发挥作用。但在过去的20年里，越来越多的研究表明，GPCRs能够在完整细胞中形成二聚体甚至高阶寡聚体。现已证实，GPCRs的A家族与C家族成员均可形成同源或异源二聚体及高阶寡聚体。虽然GPCRs单体可激活G 蛋白，但由GPCRs二聚体形成的新的配体结合位点对G 蛋白具有选择性激活的作用，如不同的GPCR二聚体选择性的激活不同亚型的G蛋白，选择性的激活不同的下游信号途径，进而参与不同的生理反应。GPCR二聚体独特的空间结构，决定了其特殊的药理学特性。因此，对GPCRs二聚体的研究将有助于我们更深入的理解受体的生理、药理功能与作用机制。 　　1　GPCRs二聚体 　　最初认为GPCRs以单体的形式存在。过去研究表明，它们可以在细胞中形成同源和异二聚体，如GPCRs　C家族(代谢型谷氨酸受体，钙敏感受体等)与A家族(视紫红质受体等)，在完整的细胞中均可以形成同源或异源二聚体及高阶寡聚体。近期研究发现，视紫红质受体-beta;-arrestin结合的化学计量比由1∶1变为2∶1，这无疑证实了受体二聚化的存在。新型技术在细胞领域的成功应用，如荧光共振能量转移(FRET)、生物发光共振能量转移(BRET)等，从大分子水平表明了活细胞中二聚体及高阶寡聚体的存在。但此技术不足以阐述二聚体及高阶寡聚体的动态性质及大小，因此，为进一步探明活细胞中二聚体及高阶寡聚体的时空分布，全内反射荧光显微镜(total　internal　reflectance　fluorescence　microscopy，TIRFM)技术应运而生。 　　TIRFM 首次用于跟踪活细胞中荧光标记的M1毒蕈碱乙酰胆碱受体(M1muscarinic　acetylcholine　receptor，M1R)与N-甲酰肽受体(N-formyl　peptide　receptors，FPR)，研究表明M1R-FPR二聚体的形成与解离瞬时完成，且在任何时间都有30%～40%的二聚体存在。随后，人们在心肌细胞中检测到M2受体，得到了与此相同的结论。近期，人们将TIRFM 与蛋白质标记(SNAP-tags)技术联合使用，用于研究活细胞中beta;1、beta;2肾上腺素受体(beta;1-adrenergic　receptors，beta;2-adrenergic　receptors)与gamma;-氨基丁酸B 型受体(gamma;-aminobutyricacid，GABAB)单分子的运动轨迹(其中细胞膜被荧光集团标记)。实验数据表明，3种受体形成二聚体及高阶寡聚体的量与受体的亚型及密度呈正相关。低密度时，beta;1肾上腺素受体主要以单体的形式存在，而beta;2肾上腺素受体形成二聚体，且随着密度的增加则逐渐形成三聚体、四聚体甚至高价寡聚体。在正常组织生理状态下的受体密度，beta;1、beta;2肾上腺素受体均以二聚体或高阶寡聚体的形式存在，即便加入激动剂刺激也不会改变这种二聚体的状态。有趣的是，GABAB即使是在低密度下也主要形成三聚体、四聚体，随着密度增加将逐步形成高阶寡聚体。TIRFM 结合荧光标记能够观察活细胞中大分子间的相互作用，进而揭示了GPCR之间的单体和二聚体的动态平衡。 　　过去几十年主要是应用能量共振转移、TIRFM及信号强度进行采集后的演算来分辨细胞中GPCRs二聚体/高价寡聚体的形成，而近期超高分辨率显微镜(super-resolution　microscopy，STED)的发展打破了传统荧光显微镜的分辨率，它能够直接观察胞内单个蛋白分子的运动轨迹，提供三维空间甚至更精细的分子水平(8nm)检测GPCRs单体、二聚体及高价寡聚体(蛋白质-蛋白质间)时空排布、相互作用及其功能。 　　荧光相关光谱(fluorescence　correlation　spectroscopy，FCS)是另一个用于探测GPCR 寡聚化状态的技术，它通过测定微区内荧光团，荧光强度的改变而评定荧光分子的数目，具有极高的灵敏度。Golebiewska等利用FCS检测到mu;-阿片受体(mu;-opioid　receptors)与delta;-阿片受体(delta;-opioid　receptor)可以形成同源或异源二聚化，且mu;-阿片受体与delta;-阿片受体形成的四聚体是在形成二聚体的基础上完成的。Herrick　Davis等将FCS与粒子