第五章 酶分子的化学修饰幻灯片.pptVIP

1. 化学修饰反应的类型 1) 烷基化反应 试剂特点：烷基上带活泼卤素，导致酶分子的亲核基团（如－NH2，-SH等）发生烷基化。 可作用基团： 氨基（Lys，Arg），巯基（Cys），羧基（Asp、Glu），甲硫基（Met），咪唑基（His）。 修饰剂：2，4－二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺等。 烷基化反应 2) 酰基化反应 试剂特点： 含有 结构，作用于侧链基团上的亲核基团，使之酰基化。 可作用基团： 氨基，巯基，醇羟基（Ser、Thr），酚羟基（Tyr） 酰基化反应 3) 氧化和还原反应 试剂特点：具有氧化性或还原性。 氧化剂：H2O2 ，N-溴代琥珀酰亚胺 可被氧化的侧链基团：巯基，甲硫基，吲哚基（Trp）、咪唑基，酚基等。 还原剂：2－巯基乙醇、DTT等。 可被还原的侧链基团：二硫键。 （二）氨基酸置换修饰 将肽链上的某一个氨基酸换成另一个氨基酸，引起酶蛋白空间构象的改变，从而改变酶的某些特性和功能的方法。 通过两个途径实现： 化学修饰法：由于可用试剂的限制，获得的种类少。 蛋白质工程：利用基因操纵技术。 （三）金属离子置换修饰 改变酶分子中所含的金属离子，使酶的特性和功能发生改变的方法。 第六章 酶的蛋白质工程 一、概念： 蛋白质工程是以创造性能更适用的蛋白质分子为目的，以结构生物学与生物信息学为基础，以基因重组技术为主要手段，对天然蛋白质分子的设计和改造。 二、蛋白质的功能基础 蛋白质的功能在很大程度上取决于其空间结构。 蛋白质结构测定 一级结构测定： 直接法：直接测定多肽链的氨基酸顺序。 间接法：从编码蛋白质的基因的核苷酸顺序来推导蛋白质的氨基酸顺序。 三级结构测定： X-射线晶体衍射——研究处在晶体状态下的蛋白质的空间结构 核磁共振(NMR)光谱——研究处在溶液状态的蛋白质的结构。 X-射线衍射技术： 用于蛋白质及核酸三维结构的确定，至今已有数百种蛋白质的结构被确定。 三、蛋白质工程的主要手段 以重组DNA技术为核心的基因工程技术改造蛋白质。 位点特异性突变——基于结构生物学、信息生物学 基因突变 随机突变——基于高通量筛选法 基因内部的剪接 基因剪接 5‘或3’端的剪接 四、蛋白质工程改造的实际应用 1.枯草杆菌蛋白酶 1）增强抗氧化性 2）改变底物特异性 2.溶菌酶（Lysozyme） 1)抗菌范围的扩大 2)热稳定性的提高 五、酶的稳定性 1.酶稳定的分子原因 1）共价键： 肽键（peptide bond） ——稳定蛋白质和酶主链的核心力量。 二硫键（disulfide bond） ——由两个Cys的侧链-SH氧化而成，是某些蛋白质维持结构稳定性的主要因素。 2）非共价键： 疏水相互作用（hydrophobic interaction）: 是维持蛋白质分子稳定的主要的作用力。 氢键（hydrogen bond）： 是稳定蛋白质分子的空间结构，特别是二级结构的重要力量。 静电相互作用（electrostatic interaction）： 又称离子键、盐键、盐桥，是正负电荷间的作用力。对酶分子稳定性有关的盐键大部分形成于分子表面上。 范德华力： 在电中性分子之间的非共价结合。分子间形成的范德华力越大越稳定。 金属离子： Ca2+、Mg2+和Zn2+等高价阳离子与多肽链不稳定的弯曲部分结合，可显著增加酶分子的稳定性。 剂型 蛋白质水平 核酸水平 适合的酶类还不普遍 适用于特殊反应体系和酶类 反应介质 工作量大 简单、经济 稳定剂 微环境改良 成本高 稳定性好，载量高，催化效率高 交联酶晶体 载量较低，易失活 适应所有酶，稳定性高，可重复利用和连续生产 固定化 修饰过程破坏酶分子 适应所有酶，操作简单经济 化学修饰 操作复杂，周期长 从根本上提高酶分子稳定性 蛋白质工程 酶分子改造 不足 优点 方法 途径 2. 稳定酶的方法 思考题： 三、反应条件的选择 要注意—— 1. 酶与修饰剂的分子比例 2. 反应体系的溶剂性质、盐浓度、pH条件 3. 反应温度及时间 第五节 酶化学修饰的种类及应用 一、酶的表面化学修饰 （一）大分子修饰（大分子结合修饰） 是目前应用最广的酶分子修饰方法。 1.定义：利用水溶性大分子与酶结合，使酶的空间结构发生某些精细的改变，从而改变酶的特性与功能的方法。 2. 修饰剂： 聚