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简答题： 基因工程的基本过程：①获取目的基因②重组体的制备③重组体的转换④重组体筛选和鉴定⑤外源基因在宿主细胞中的表达 基因工程的基本原理：①提高外源基因的剂量—分子遗传学原理②筛选修饰重组基因表达的转录调控元件，如启动子、增强子等—分子生物学原理③修饰构建蛋白质生物合成的翻译调控元件-分子生物学原理④基因工程菌（微型生物反应器）的增殖及稳定生产-生化工程学原理。 DNA重组载体的功能：①为外源基因提供进入受体细胞的转移能力②为外源基因提供在受体细胞中的复制能力或整合能力③为外源基因提供在受体细胞中的扩增和表达能力 DNA重组载体所具备的的条件：①具有对受体细胞的可转移性或亲和性，以提高载体导入受体细胞的效率②具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点，使得外源基因在受体细胞中稳定遗传③具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点，有利于外源基因的剪接插入。 质粒的分类、用途及区别：①克隆质粒：常用于克隆和扩增外源基因②测序质粒：通常高拷贝复制，含有多酶切口的街头片段，便于各种DNA片段的克隆与扩增③整合质粒：含有整合酶编码基因及整合特异性的位点序列，克隆在这种质粒上的外源基因进入细胞后，能准确地重组整合在受体细胞染色体DNA的特定位点上。④穿梭质粒：含有两个亲缘关系不用的复制子结构以及相应的选择性标记基因，能在两种不同种属的受体细胞中复制检测⑤探针质粒：被设计用来筛选克隆基因的表达调控条件⑥表达质粒：使克隆在合适位点上的任何外援基因均能在受体细胞中高效表达 λ噬菌体和Cos质粒区别：黏粒重组分子进入受体细胞后，依靠质粒DNA部分的复制子结构进行自主复制，其拷贝数取决于质粒本身的性质，而且由于重组分子失去了体内包装的能力，故其分离纯化只能采用质粒的方法。 T4-DNA连接酶的生物活性：①修复双链DNA上的单链缺口②连接RNA-DNA杂交双链上的DNA链缺口或RNA链缺口③连接完全断开的两个平头双链DNA分子。 T4-DNA的修饰性活性：①5’ →3’的DNA聚合活性②3’ →5’的核酸外切酶活性③无5’ →3’的核酸外切酶活性。 Ⅰ类酶 Ⅱ类酶（最常用于DNA重组） Ⅲ类酶 酶分子 三亚基双功能酶 内切酶和甲基化酶不在一起 三亚基双功能酶 识别位点 二分非对称序列 4-6bp短序列，大多数为回文结构 5-7bp非对称序列 切割位点 距离识别位点至少1000bp，无特异性 在识别位点中或靠近识别位点 在识别位点下游24-26bp处 限制反应与甲基化反应 互斥 分开的反应 同时竞争 限制作用是否需要ATP 需要 不需要 需要 Klenow酶的生物活性：①5’ →3’的DNA聚合活性，使DNA链在模板的指导下延伸②3’ →5’的核酸外切酶活性，其主要功能是识别并切除错配的碱基，保证DNA复制的准确性③无5’ →3’的核酸外切酶活性④无核酸内切酶活性 Klenow酶的副反应即催化活性：①修复由限制性核酸内切酶造成的3’凹端，使之成为平头末端②以含有同位素的脱氧核苷酸为底物，对DNA片段进行标记③用于催化cDNA第二链的合成④用于双脱氧末端终止法测定DNA的序列 受体细胞的类型及其特点：①限制缺陷型：打破细菌转化的种属特异性，提高任何来源的DNA分子的转化效率。②重组缺陷型：具有依赖于ATP的双链DNA外切酶和单链DNA内切酶双重活性，用于以外源基因克隆、扩增以及表达为目的的基因工程实验。③转化亲和型：利用遗传诱变技术改变受体细胞壁的通透性，提高转化效率④遗传互补型：具有与外源基因表达产物活性互补的遗传特征⑤感染寄生缺陷型：对其他生物具有感染和寄生效应，将重组DNA分子导入后，极有可能随着受体菌的感染寄生作用，进入生物体，并广泛传播。 以植物为例，常用的转基因方法（14种）①细胞融合②微细胞介导的基因转移③染色体介导的基因转移④脂质体介导的基因转移⑤磷酸钙沉淀介导基因转移⑥原生质体融合术⑦显微注射法⑧电脉冲介导的基因转移⑨重组DNA病毒感染⑩重组RNA病毒感染?直接转化法?接合转移法?超声波法?基因枪法每种方法要懂得基因转移大概的原理，不能单纯只知道名字。 大肠杆菌作为转基因受体的特点：⑴优点：①全基因组测序，共有4405个可读框②基因克隆表达系统成熟完善③繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定④被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物。⑵缺点：①缺乏对真核生物蛋白质的复性功能②缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统③内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白④细胞周质内含有种类繁多的内毒素 作为一个真核生物表达系统，酵母的优势：①全基因测序，基因表达调控机制比较清楚，遗传操作简单；②具有原核细菌无法比拟的真核生物蛋白翻译后修饰加工系统；③不含有特异性的病毒，不产生毒素；④大规模发酵工艺简单，成本低廉；⑤能将外源基因表达产物分泌至培养基中；⑥酵母是