酶工程的研究及进展.docVIP

LUOYANG NORMAL UNIVERSITY 2010年酶工程学年论文 分子酶工程研究进展 院（系）名称 生命科学系 专 业 名 称 生物科学 学生姓名 李艳艳 学号 101314022 指导教师 程彦伟 完 成 时 间 2013年12月 分子酶工程研究进展 李艳艳 （生命科学系 生物科学专业学号：101314022） 摘 要： 酶工程的研究已经发展到分子水平，通过基因操作，已实现了许多酶的克隆和表达定点突变成为研究酶结构与功能的常规手段，并被广泛用于改善酶的性能。体外分子进化方法则大幅提高了酶分子的进化效率，并有可能发展新功能酶。融合蛋白技术的发展使构建新型多功能融合酶成为可能。这里对分子酶工程学的研究与发展情况进行了综述。 关键词：分子酶工程；基因克隆；改造；定向进化；融合；人工模拟 酶，由于其特异和高效的催化作用，在生命活动中扮演重要的角色。其中，尤其是源于微生物的酶。很早就被广泛开发服务于人类的各种需求，如酿造、酶法转化、疾病诊断与治疗、药物生产、环境污染物去除，等等。然而，天然酶常常十分昂贵，且大多数酶由于非常“娇嫩”而难以实际应用。近年来，结构生物学和基因操作技术的发展使得科学家能够对酶分子进行有效地改造，甚至开始为“目的”而设计，从而导致了分子酶工程学的发展。概括地说，分子酶工程学就是采用基因工程和蛋白质工程的方法和技术，研究酶基因的克隆和表达、酶蛋白的结构与功能的关系以及对酶进行再设计和定向加工，以发展性能更加优良的酶或新功能酶。当前的研究热点可以概括为3个方面：一是利用基因工程技术大量生产酶制剂；二是通过基因定点突变和体外分子定向进化对天然酶蛋白进行改造；三是通过基因和基因片段的融合构建双功能融合酶。 1 酶的基因克隆与异源表达 天然酶在生物体中含量一般较低，难以提取和大量制备。限制了它的推广应用。重组DNA技术的建立，使人们可以较容易地克隆各种各样天然的酶基因，并将其在微生物系统中高效表达，从而在很大程度上摆脱对天然酶源的依赖。这一技术已成功地应用于酶制剂的工业生产。世界上最大的工业酶制剂生产商丹麦Novozymes公司生产的酶制剂80％为基因工程产品。我国在这个领域中也取得了令世人瞩目的研究成果。黄日波教授研究小组从广西象州温泉中分离到一株硫矿硫化叶菌，并根据基因序列库Genbank中提供的麦芽寡糖基海藻糖合酶和麦芽寡糖基海藻糖水解酶的DNA基因序列，利用PCR技术从中克隆到MTSase和MTHase，分别构建了含MTSase、MTHase基因的表达载体pHp-Jkint，将其分别整合到汉斯多形酵母染色体中，成功地构建了生产海藻糖工程菌，其表达量达60万U几MTSase和3万U／L MTHase。经这2个酶的联合作用，使木薯淀粉中葡萄糖以80％的转化率转化为海藻糖，现已投入工业化生产。 2 酶分子的定向改造和进化 酶分子本身蕴藏着很大的进化潜力，许多功能有待于开发。分子酶工程设计可以采用定点突变和体外分子定向进化两种方式对天然酶分子进行改造。定点突变需要知道酶蛋白的一级结构及编码序列，并根据蛋白质空间结构知识来设计突变位点。体外定向进化是近几年新兴的一种蛋白质改造策略，可以在尚不知道蛋白质的空间结构，或者根据现有的蛋白质结构知识尚不能进行有效的定点突变时，借鉴实验室手段在体外模拟自然进化的过程(随机突变、重组和选择)，使基因发生大量变异，并定向选择出所需性质或功能，从而使几百万年的自然进化过程在短期内得以实现。 2．1 定点突变 定点突变技术可以随心所欲地在已知DNA序列中取代、插入或缺失一定长度的核苷酸片段。该方法与使用化学因素、自然因素导致突变的方法相比，具有突变率高、简单易行、重复性好的特点。利用定点突变技术对天然酶蛋白的催化性质、底物特异性和热稳定性等进行改造已有很多成功的实例 。葡萄糖异构酶是工业上大规模以淀粉制备高果糖浆的关键酶，也是国际上公认的研究酶催化机制及建立蛋白质工程技术最好的模型之一。为提高葡萄糖异构酶的热稳定性，朱国萍等人 用双引物法对葡萄糖异构酶基因进行了体外定点诱变，以Pro138替代Gly138，在酶比活相近的情况下，突变型葡萄糖异构酶的热半衰期比野生型长一倍，最适反应温度提高10～12~C。据分析，可能由于Pro138替代Gly138引入的一个吡咯环刚好能够填充Gly138附近的空洞，使突变蛋白的空间结构更具刚性，从而提高了酶的热稳定性。然而，定点突变技术只能对天然酶蛋白中少数的氨基酸残基进行替换，酶蛋白的高级结构基本维持不变，因而对酶功能的改造较为有限。同时，由于已有的结构与功能相互关系的信息远远不能满足当今人们对蛋白质新功能的要求，因此目前采用体外分子定向进化的方法来改造酶蛋白的研究越来越多，并