多效生长因子（PTN）mRNA及其蛋白在结直肠癌组织中的表达及临床意义.docVIP

多效生长因子（PTN）mRNA及其蛋白在结直肠癌组织中的表达及临床意义 　　【摘要】 目的：探讨结直肠癌组织中多效生长因子（PTN）mRNA及其蛋白的表达情况及临床意义。方法：购买结直肠癌组织芯片标本90例（实验组），正常结直肠组织芯片70例（对照组），采用原位杂交和免疫组化染色方法，检测两组PTN mRNA及其蛋白的表达；另选择2009年11月-2013年12月手术治疗的原发结直肠癌患者90例，分析PTN mRNA及其蛋白表达与结直肠癌患者临床病理特征的关系。结果：实验组PTN mRNA阳性表达率为62.2%，PTN蛋白阳性表达率为58.9%，与对照组比较差异均有统计学意义（P0.05）；不同TNM分期和不同分化程度，PTN mRNA及其蛋白阳性表达差异具有统计学意义（P0.05）。结论：PTN mRNA及其蛋白与肿瘤分期和分化程度有密切关系，可作为判断结直肠癌预后的参考依据。 　　【关键词】 多效生长因子； PTN蛋白； 结直肠癌组织 　　结直肠癌是临床常见的恶性肿瘤之一，具有较高的死亡率，我国作为结直肠癌的高发国家，其发病率呈显著上升趋势[1-2]。PTN作为重要的生长因子，具有多信号功能，能够促进神经系统发育、血管发生及刺激细胞增殖和迁移[3-4]。本文回顾性分析PTN在结直肠癌组织中的表达情况，旨在为判断预后提供参考。 　　1 资料与方法 　　1.1 一般资料 购买由陕西超英生物科技有限公司生产的结直肠癌组织芯片标本共90例（实验组），正常结直肠组织芯片70例（对照组）。另选择2009年11月-2013年2月手术治疗的原发性结直肠癌患者90例，男52例，女38例；年龄20～75岁，中位年龄53岁；其中55岁共43例，≥55岁共47例；直肠癌37例，结肠癌53例；肿瘤TNM分期：Ⅰ期12例，Ⅱ期48例，Ⅲ期24例，Ⅳ期6例；分化程度：高分化63例，中低分化27例。所有标本均经组织病理学检查证实为结直肠癌。 　　1.2 实验方法 　　1.2.1 实验仪器 SantaCruz公司生产的人重组PTN细胞因子、PTN 单克隆抗体以及PTN多克隆抗体；西安沃尔森生物科技有限公司生产的原位杂交试剂盒、碱性磷酸酯酶显色试剂盒、免疫组化试剂盒及无水乙醇；上海生工生物工程有限公司制造的PTN探针；浙江临安电子器材厂制造的YWY781型医用微波仪；德国Leica光学显微镜。 　　1.2.2 PTN mRNA检测 原位杂交法：（1）二甲苯脱蜡处理石蜡切片，1 g/L蛋白酶K作用15 min；双蒸水洗1 min后用无水乙醇洗2 min，吹干。（2）预杂交：预杂交液（50 μL）滴加在切片上，置于42 ℃恒温箱孵育30 min，去除预杂交液。（3）杂交：杂交液（20 μL）滴加在切片上，硅化盖玻片盖好后放置在37 ℃湿暗盒中24 h。（4）免疫检测：0.5 mL Buffer1清洗2 min后，滴加30 μL浓度为0.1 mol/L中性盐溶液和10%聚乙二醇辛基苯基醚，再滴加1.0 mL Buffer1，室温孵育30 min，滴加15 μL浓度为0.1 mol/L的NSS和45μL 10% TritonX-100，滴加Buffer1到1.5 mL，同时滴加50 μL抗地高辛抗体，室温下孵育2 h；Buffer1清洗2次后Buffer3清洗，光学显微镜下，在暗盒内监控显色反应程度，细胞浆染色与细胞外背景表现为明显差异时用Buffer4终止反应；（5）核固红衬染5 min，脱水后以中性树胶封片。PTN 探针序列：地高辛标记3′端，锁核酸修饰中部“（T）”的碱基。阴性对照使用PBS替代杂交液。 　　1.2.3 PTN蛋白检测 免疫组化染色法：参照文献[5]采用微波-EliVision TM法进行操作。阳性对照为PTN蛋白阳性表达的直肠癌组织，阴性对照为PBS代替一抗。 　　1.3 评价标准 参照文献[5]对原位杂交及免疫组化染色结果进行评价。（1）PTN探针杂交阳性：细胞质和细胞核中发现浅蓝色至深蓝色颗粒。每张切片随机选择5个高倍视野进行测定平均阳性反应面积。阴性：阳性面积≤20%；阳性：阳性面积20%。（2）免疫组化染色阳性：细胞浆内发现浅棕至深棕色颗粒。随机选取5个高倍视野，计算平均阳性染色细胞率。阴性：阳性染色细胞率50%。（3）染色强度计分：不着色：1分，淡黄色：2分，浅棕色：3分，深棕色：4分。两种计分相乘后，乘积值依次对应0、2、6及12分，0和2为阴性，6和12为阳性。 　　1.4 统计学处理 应用SPSS 16.0统计学软件对数据进行处理，计量资料以（x±s）表示，比较采用t检验，计数资料应用字2检验，以P0.05表示差异有统计学意义。 　　2 结果 　　2.1 PTN mRNA及其蛋白表达结果 两组