动态显色法检测注射用重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子中内毒素的含量.docVIP

动态显色法检测注射用重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子中内毒素的含量 　　[摘要] 目的 建立定量检测注射用重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）中内毒素的质控方法。 方法 采用动态显色法，通过标准曲线的可靠性验证和干扰试验，建立检测rhGM-CSF中内毒素的定量方法。 结果 标准曲线可靠性验证中，曲线的R2均0.98，标准曲线成立；干扰试验显示，供试品复溶后稀释5倍后加入0.5 EU/ml的标准内毒素作为供试品回收液，经检测其内毒素回收率均接近100%，该稀释倍数下，供试品浓度对内毒素实验的干扰作用较小；另外，日常检测2批供试品的内毒素含量均小于限值，与凝胶法检测结果一致。 结论 该动态显色法方法可用于rhGM-CSF中内毒素的定量检测。 　　[关键词] 动态显色法；注射用重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子；内毒素；定量 　　[中图分类号] R927.12 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2014）03（a）-0012-03 　　细菌内毒素是目前医药工业中最普遍和最主要的外源性致热原[1]，它是G-菌细胞壁的脂多糖成分，能够在有机体内作用于单核巨噬细胞，产生肿瘤坏死因子、白细胞介素、前列腺素、凝血素及干扰素等多种细胞因子，这些因子过量时可引起机体发热、心动过速，甚至休克[2]。因此，为了保证注射剂药品的安全使用，各国药典均将热原检测列为重要检查项目，热原控制也成为药品生产质控的重要对象之一[3-4]。 　　Levin和Bang于1968年发现并建立了鲎试剂法进行体外检测细菌内毒素[5]，该法简便快速、灵敏度高及重现性好的优点使其迅速成为热原检测中家兔法的替代方法[6]。目前所使用的鲎试剂法多为凝胶限值法，《中国药典》对注射用重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）的细菌内毒素检查也采用该法。凝胶法是目前最常用的细菌内毒素检查法，但其是一种半定量测定方法，无法给出准确的含量。因此，为了更好满足药品检查和生产过程质控的严格要求，内毒素检测已逐渐向定量方向发展，其中，动态显色法是目前灵敏度最高和检测范围最宽的定量测定法，该法是通过检测反应产物中对硝基苯氨到达某一预设吸光度所需要的反应时间来检测样品中的内毒素含量[7]。因此，动态显色法已被各国药典逐渐推广并应用于药品中细菌内毒素的定量检测[8]。国内目前采用动态显色法进行内毒素检测的报道尚不多见，本研究参照《中国药典》2010年版细菌内毒素检查法进行试验[9]，并将结果与凝胶法进行比较，探讨并研究动态显色法定量检测rhGM-CSF中细菌内毒素的可行性。 　　1 材料与方法 　　1.1 仪器与试剂 　　XW-80A型漩涡混合器（上海医大仪器有限公司）；Spectra Max 340PC384型酶标仪（美国Molecular Devices）。 　　细菌内毒素工作标准品（CSE，批号：1205040；规格：10 EU/支，湛江安度斯生物有限公司）；动态显色法鲎试剂（KCA，批号：1203020；规格：1.25 ml/支，灵敏度0.005 EU/ml，湛江安度斯生物有限公司）；鲎试剂（TAL，批号：110604；规格：0.1 ml/支，灵敏度0.5 EU/ml，厦门鲎试剂厂）；细菌内毒素检查用水（BET水，批号：1211120；规格：5 ml，湛江安度斯生物有限公司）。 　　1.2 方法 　　1.2.1 细菌内毒素限值的确定 　　《中国药典》规定rhGM-CSF原液中内毒素的限值为10 EU/300 μg，成品中内毒素限值为10 EU/支。公司内部将安全系数提高10倍，成品中限值确立为L=1 EU/支。试验中rhGM-CSF成品规格为100 μg/瓶，则限值可表示为10 EU/mg。 　　1.2.2 标准曲线的可靠性验证 　　取细菌内毒素工作标准品1支，加入1 ml BET水复溶为10 EU/ml的储备液。将10 EU/ml标准品用BET水稀释为5、0.5、0.05、0.005 EU/ml的标准内毒素系列溶液。取无热原微孔板，每孔加入100 μl的BET水（阴性对照）和各浓度标准液，均平行3孔。再加入100 μl的动态显色鲎试剂并混匀，放入酶标仪中于37℃孵育60 min，每隔1 min 检测样品在405 nm的吸光度（OD）。 　　1.2.3 干扰试验 　　①供试品最大稀释倍数（MVD）计算：rhGM-CSF成品规格为100 μg/瓶，复容后体积为1 ml，即浓度为0.1 mg/ml，限值为10 EU/mg。根据MVD=cL/λ，c为供试品浓度，L为限值，λ为鲎试剂的灵敏度0.005 EU/ml，则MVD=200（倍）。②预实验：制备终浓度为5、0.5、0.05、0.005 EU/ml的标准内毒素溶液，将r