六味地黄汤对慢性肾功能衰竭大鼠肾组织缺氧诱导因子1α及相关因子表达的影响.docVIP

六味地黄汤对慢性肾功能衰竭大鼠肾组织缺氧诱导因子1α及相关因子表达的影响 　　摘要：目的 探讨缺氧诱导因子（HIF）-1α、血小板源性生长因子（PDGF）-A及PDGF-B在慢性肾功能衰竭大鼠肾组织中的表达及作用，观察六味地黄汤对其表达的影响。方法 用5/6肾切除法复制慢性肾功能衰竭模型，分假手术组，模型组和六味地黄汤组。造模后12周，检测各组肾功能指标，HE染色法观察肾组织病理变化，Masson染色法观察肾组织胶原的沉积，免疫组化法和RT-PCR法分别检测HIF-1α、PDGF-A和PDGF-B在肾组织中的表达。结果 24 h尿蛋白、血尿素氮和血肌酐在模型组明显升高（P0.01），六味地黄汤组则明显降低（P0.01）。模型组肾间质纤维化明显，大量胶原纤维沉积；六味地黄汤组肾间质纤维化程度明显减轻，少量胶原纤维沉积。与假手术组比较，模型组肾组织中HIF-1α、PDGF-A及PDGF-B蛋白水平和基因表达均明显升高（P0.01）；与模型组比较，六味地黄汤组肾组织中HIF-1α、PDGF-A及PDGF-B蛋白水平和基因表达均明显降低（P0.01），且PDGF-A和PDGF-B的表达与HIF-1α均呈正相关（P0.01）。结论 HIF-1α可能通过上调PDGF-A和PDGF-B的表达促进肾间质纤维化，六味地黄汤可下调HIF-1α的表达，从而抑制肾间质纤维化。 　　关键词：慢性肾脏病；缺氧诱导因子1α；大鼠；5/6肾切除；六味地黄汤 　　中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2013）04-0044-04 　　已有研究显示，多种病因导致的慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）普遍存在肾小管间质的缺血缺氧，慢性缺氧致肾小管间质损伤是终末期肾脏疾病的最后共同通路[1]。英国学者Fine提出的“慢性缺氧学说”成为目前CKD学界研究的热点。该学说提出，肾小管间质部分的慢性氧缺失是促进肾脏疾病进展和纤维化的重要原因[2]。缺氧可增加缺氧诱导因子（hypoxia-inducible factor，HIF）表达，而HIF可上调结缔组织生长因子（CTGF）、血浆纤溶酶原激活物抑制剂（PAI-1）、组织金属蛋白酶抑制剂（TIMP-1）等，促使肾间质纤维化[3]。血小板源性生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF）能够促进肌纤维母细胞产生胶原[4]，并通过抑制胶原酶[5]，减少细胞外基质（ECM）的降解，最终导致ECM合成增多、降解减少，过度沉积，形成纤维化。本研究旨在通过体内动物实验探讨HIF-1α、PDGF-A、PDGF-B在肾间质纤维化中的表达和作用，以及六味地黄汤对其表达的影响。 　　1 材料与方法 　　1.1 动物 　　SPF级雄性SD大鼠30只，体质量（200±10）g，湖南中医药大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK（湘）2009-0001，饲养于湖南中医药大学SPF级动物房。 　　1.2 药物与试剂 　　六味地黄汤（熟地黄24 g，山药12 g，山萸肉12 g，泽泻9 g，茯苓9 g，牡丹皮9 g）饮片购自湖南中医药大学第一附属医院药剂科。先将药材用5倍自来水浸泡2 h，煮沸后再微火煎熬30 min，过滤后收集煎液，原药渣加少量水煎煮，取二煎液。将两煎液混合，于水浴恒温器上浓缩为1 g原药材/mL。一抗为兔抗大鼠HIF-1α、PDGF-A、PDGF-B多克隆抗体（美国Santa Cruz），PV-6001二步法免疫组化检测试剂盒，二抗山羊抗兔IgG-HRP多聚体PV-6001（北京中杉金桥公司），DAB 显色试剂盒（武汉博士德生物技术有限公司），Trizol（美国MRC公司），引物为英潍捷基（上海）贸易有限公司合成，RT试剂盒（美国Fermentas公司），反转录试剂盒（Promega公司），Taq DNA 聚合酶和dNTPs（美国Fermentas公司）。 　　1.3 造模 　　参考文献[6]方法，以10%水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉动物，常规消毒铺巾，从左腹部切口，打开腹腔，静脉夹夹住肾蒂后切除左肾上下极（切除2/3），以明胶海绵压迫止血，复位肾脏，1周后进行第2次手术，切除右侧肾脏。假手术组采取同样步骤，打开腹腔暴露肾脏后避免牵拉肾脏，不切除肾脏。 　　1.4 分组 　　SD雄性大鼠适应性喂养1周后随机分为假手术组、模型组和六味地黄汤组，每组10只，模型组、六味地黄汤组均在无菌条件下进行5/6肾切除术。 　　1.5 给药 　　造模后第2日，六味地黄汤组予以六味地黄汤煎煮方灌胃，给药剂量按70 kg成人的体表面积换算。假手术组和模型组以等容积蒸馏水灌胃，每日1次，连续12周。