同源克隆过程简介.docVIP

同源克隆简介 一、 材料准备和冷诱导 2 二、 RNA提取和反转录 2 三、 PCR扩增基因中间片段和回收 2 四、 体外连接和转化 3 五、 菌落筛选和测序 3 六、 序列分析和race引物设计 3 七、 race法获取基因的3’和5’末端 4 八、 基因全长拼接和生物信息学分析 4 同源克隆简介 材料准备和冷诱导 材料培养 材料冷诱导 RNA提取和反转录 1. RNA提取准备 参考文件夹RNA提取相关知识 2. RNA提取过程 参考文件夹RNA提取过程 RNA反转录为cDNA RNA 5ul/8ul 体系 oligodT 1ul 15ul RNaseFree-ddH2O 补足15ul 70℃ For 5 min 冰预 For 5 min 加入 5×buffer 5ul dNTP 1.25ul 体系 RRI 1ul M-MLVR 1ul RNaseFree-ddH2O 1.75ul 42℃ For 1h PCR扩增基因中间片段和回收 同源引物设计 理解如何进行设计，并学着去同源引物设计（参考生物信息学材料） PCR体系 25ul cDNA模板 2.5ul ddH2O 17.2ul Buffer 2.5ul Taq酶 0.4ul dNTP 0.4ul 引物 上下游各1ul,共2ul（参考抗寒基因引物文件夹） 反应程序 94℃ for 5min 94℃ for 30s 45℃-58℃ for 45s 72℃ for 1min Go to 2 , 5 times 94℃ for 30s 55℃ for 45s 72℃ for 1min Go to 6, 30times 72℃ for 10min 16℃ for ever end 其中反应体系和程序可根据实际情况进行改变，注意理解每一步的原由。 电泳检测 理解琼脂糖凝胶电泳全过程及相关注意事项（查阅资料） 切胶回收 参考DP209--离心柱型--普通D（pdf文件） 体外连接和转化 体外连接 参考pGM-T克隆试剂盒 转化 准备工作 a LB培养基配制 b 感受态细胞制备 转化过程 参考pGM-T克隆试剂盒 菌落筛选和测序 利用а互补作用进行蓝白斑筛选，从转化的平板中挑去白斑画线扩大培养； 选择画的好的线，进行菌落PCR，过程同普通PCR ,只是把原来的模板换作ddH2O； 选择PCR出条带的线条进行摇菌，送公司进行测序。 序列分析和race引物设计 利用DNAMAN和Primer5.0 以及NCBI网站进行序列分析和RACE引物设计 race法获取基因的3’和5’末端 RACE法获取cDNA 两端（查阅资料） 基因全长拼接和生物信息学分析 race 法获得两段片段之后，将整个基因整合在一起，所得序列进行Blastn验证和序列结构分析。 2