实验五B2-荧光光度法测定负荷尿中核黄素含量.docVIP

荧光光度法测定负荷尿中核黄素含量 实验目的及意义 掌握标准曲线法定量分析维生素B2（核黄素）的基本原理。 了解荧光分光光度计的基本原理、结构及性能，掌握其基本操作。 实验原理 标准曲线法定量分析核黄素的基本原理。 核黄素是橘黄色无臭的针状结晶，其结构式为： 核黄素溶液在440nm~500nm波长光照射下发出黄绿色荧光。在稀溶液中，实验条件一定时，荧光强度F与核黄素的浓度成正比，在波长525nm下测定其荧光强度。 2、荧光分光光度计基本原理与结构 荧光计的示意图 由光源发出的紫外可见光通过激发单色器分光后，照射到样品溶液上，在波长λex 的紫外可见光激发下，样品发出荧光。为了防止激发光的干扰，在与激发光垂直的位置上检测样品的荧光。样品发出的荧光通过发射单色器分光后（它可以把容器的反射光、溶剂的散射光以及溶液中杂质所产生的荧光除去，只让特征波长的荧光通过）照到检测器上，检测器得到相应于各种荧光波长λem时的荧光强度F。 26/sdresearchms/login四、实验步骤 1. 负荷尿样的收集 棕色尿瓶洗净、晾干。于尿瓶中加入1g草酸，使尿PH3-5，以保证维生素不易破坏。尿瓶标签注明姓名、性别、编号、试验日期。 晨起排尿后，吞服维生素B25mg，饮水200~500mL，记录时间。服药四小时内，小便留于瓶内，且到四小时时再次排尿于尿瓶中。 2. 测试尿样的制备 调节尿PH至1左右。量筒测量4h收集尿液体积V4h尿(mL)，根据常识尿负荷试验排出核黄素的量及尿液的体积，估计需要稀释的倍数。建议稀释2.5倍或10倍，稀释用酸性水稀释。 3. 系列标准溶液的制备 取核黄素标准储备液（10.0μg/mL）1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL分别置于50mL的容量瓶中，各加入酸性水稀释至刻度，摇匀。得浓度依次为0.2μg/mL、0.4μg/mL、μg/mL、0.6μg/mL、0.8μg/mL、1.0μg/mL的核黄素标准溶液，待测。 4. 标准溶液及样品的荧光测定 将激发波长420nm（440nm）和发射波长530nm（525nm）处测定核黄素标准溶液的荧光强度。记录数据。以溶液的荧光发射强度为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标，制作标准曲线。 在同样条件下测定稀释尿样的荧光强度，并由标准曲线确定稀释尿样中核黄素的浓度，计算4h尿样中总的核黄素的含量。 五、数据记录与结果分析 记录计算机分析稀释后尿样品的核黄素浓度结果c（ug/mL）， 则原来未知负荷尿液中核黄素含量为C(ug)=c*稀释倍数*V4h尿 思考题： 为什么在酸性且避光条件条件下进行核黄素测定。 每下午27人算，共6个留尿瓶，2个大量筒1000mL500mL 标准组：250mL棕色容量瓶，5个50mL棕色容量瓶，1000mL容量瓶(配酸性水用)，广口瓶数个（装酸性水），2mL5mL移液管 测尿组：每组测2个尿样，每组需：2个棕色容量瓶，2个10mL移液管，2个5mL移液管，1个吸耳球，1个100mL量筒，1个玻璃棒，2个吸管，PH试纸，及小瓶浓硫酸以调尿PH至1。 注：关于光 a 紫光范围400nm-435nm，紫光同紫外线不同，紫外线是电磁波谱中波长从10nm到400nm辐射的总称，不能引起人们的视觉。1801年德国物理学家里特发现在日光光谱的紫端外侧一段能够使含有溴化银的照相底片感光，因而发现了紫外线的存在 光源 第一单色器 样品池 第二单色器 检测器 放大和显示 I0 F