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实验七 质粒酶切及连接 1.分：分离出要克隆的目的基因及载体。 目的基因的分离： 直接分离DNA—适用于克隆原核生物的基因组文库 构建基因组文库，筛选目的基因 构建cDNA文库，筛选目的基因 PCR扩增目的基因片段 人工合成较短的DNA片段 命名：酶来源的生物名称缩写 属名-种名-株名-发现次序 分类：限制性核酸内切酶根据识别切割特性，催化条件及是否具有修饰酶活性分为三大类。 Ⅱ型限制性核酸内切酶的特点及作用特性 Ⅱ型酶限制修饰系统分别由限制酶和修饰酶两种不同的酶组成。 它的分子量小，仅需Mg2＋做辅助因子，它们能识别双链DNA的特异顺序，并在这个顺序内进行切割。 识别顺序一般为4－6个碱基对，识别顺序具有180度的旋转对称性，具有回文结构。 Ⅱ型酶切割双链DNA产生2种不同切口 平末端：在识别顺序的对称轴上，对DNA同时切割形成平末端，如：SmaI 粘末端： 5′突出粘末端：在识别序列的两侧末端切割DNA双链，于对称轴的5 ′末端切割产生5 ′端突出的粘性末端，如：Hind III 3 ′突出粘末端:与5′突出粘末端作用相反，产生3 ′端突出粘末端，如：Pst I 限制性核酸内切酶的单位 在适当的条件下（T，pH，离子强度等）一小时内完全酶解1μg特定DNA底物所需要的限制性核酸内切酶的量，定义为1个活性单位。 目前常用的酶单位的定义是：37℃ ，1小时内50ul反应体系完全酶解1 μ gλ DNA所需的酶量。 在建立酶切体系时，酶的用量一般为1－5U/μgDNA 星号活力 限制性核酸内切酶在非标准反应条件下，能够切割一些与其特异识别顺序类似的序列，这种现象称为星号活力。 星号活力出现的原因： 酶用量太大 100U / ug DNA 酶切体系中离子强度太低， 25mM 正常为100－150mM 甘油浓度过高 10％ （V/V） EcoR I 反应体系pH值过高 8 Pst I 一般反应体系的pH为7.0左右 反应体系中存在有机溶剂，如乙醇，DMSO等 有与Mg竞争的其它二价阳离子，如Mn离子 内切酶解时注意事项 限制性内切酶需低温保存 酶切反应时最后加酶 更换吸头，避免污染 注意酶的加入量 酶解温度及时间的控制 加完酶后要在离心机上“甩”一下，混匀 为什么要分步酶切? 同步双酶切是一种省时省力的常用方法。选择能让两种酶同时作用的最佳缓冲液是非常重要的一步。内切酶在非最佳缓冲液条件下的切割速率会减缓，如果找不到一种可以同时适合两种酶的缓冲液，就只能采用分步酶切。分步酶切应从反应要求盐浓度低的酶开始。 3.连：将切割后的目的基因和载体用T4DNA连接酶连接 DNA连接酶（DNA ligase） DNA的连接是在一定条件下，由DNA连接酶催化两个双链DNA片段相邻的5 ′端磷酸与3 ′端羟基之间形成磷酸二酯键的过程。 相同或不同的限制性内切酶产生的粘性末端，在降至退火温度时，能重新互补结合，在DNA连接酶的催化下，目的基因就与载体相连接。 DNA连接酶主要分为两种： T4DNA连接酶 催化dsDNA粘末端连接及平端连接 大肠杆菌连接酶 不能催化平末端连接,其底物只能是带缺口的双链DNA分子和具有同源互补粘末端的不同DNA分子 T4DNA连接酶的特性 T4DNA连接酶是T4噬菌体基因30编码的产物。最早是从T4噬菌体感染的大肠杆菌中提取的。分子量为68KD，需要ATP作为辅助因子并由ATP提供能量。 T4DNA连接酶缓冲液的成分及作用 常用的反应液为pH7.6的Tris－Hcl，连接最佳pH7.2-7.8 需要ATP作为辅助因子并由ATP提供能量 DTT等巯基化合物可促进连接酶的连接作用 高浓度的Na+,K+等抑制酶的活性 T4DNA连接酶的作用条件 对于粘性末端一般在12－15 ℃之间进行反应，比较通用的条件是16 ℃过夜连接。 4.转：把连接好的重组载体转化入感受态细胞的过程（细菌：E.coli，真菌：Yeast，昆虫细胞或哺乳动物细胞）。 5.筛：在不同层次上、不同水平上进行筛选，鉴定所需的特异性重组子。使用各种方法，将带有重组载体的宿主菌从培养基中筛选出来。例如：载体大小，酶切结果，筛选标记等。 实验步骤 1.在紫外灯下将目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下，放干净的离心管中，称取重量。 2.向胶块中加入3倍体积溶胶液PN Buffer。放入50℃水浴箱中，加热融化胶块，此时应间断振荡混合，使胶块充分融化(约6~10分钟)。 （凝胶体积：100mg相当于100 ul ） 3.将上一步所得溶液加入吸附柱CA2中